不同濃度的ＩＬ－１β和ＴＧＦ－β１對大鼠肋軟骨細胞的影響

[摘要]目的：研究人白細胞介素-1β（IL-1β）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)對體外培養(yǎng)的SD大鼠肋軟骨細胞功能的影響。方法：采用免疫組織化學(xué)檢測不同劑量IL-1β和TGF-β1作用48h后軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達水平。采用RT-PCR方法檢測細胞Ⅱ型膠原、aggrecanase-1，2、aggrecan的 mRNA的表達水平。結(jié)果：IL-1β可以促進軟骨細胞aggrecanase-1，2的表達，從而降低多聚蛋白聚糖的含量，破環(huán)細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，減少II型膠原的含量，使細胞呈現(xiàn)去分化的表現(xiàn)，對軟骨細胞起負性調(diào)節(jié)作用。低濃度的TGF-β1對軟骨細胞起保護的作用；高濃度的TGF-β1（100ng/ml）在促進蛋白多糖表達的同時也促進軟骨細胞蛋白多糖的降解，從而打破軟骨的代謝平衡，起負性調(diào)節(jié)的作用。

[關(guān)鍵詞]IL-1β；TGF-β1；軟骨細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）08-1166-05

The effects ofIL-1β and TGF-β1 on rat costochondral chondrocytes

WANG Li， WANG Zheng-hui， YANG Zhuang-qun， LI Li-xia， TU Jun-bo， LI Guo-guang

(Department of Oral and Maxillofacial Plastic Surgery， Stomatological Hospital， Xi'an Jiaotong University， Xi'an 710004， Shaanxi， China)

Abstract:ObjectiveIn order to study IL-1βand TGF-β1 have what effects on SD rat chondrocyte cell.MethondsDifferent dosis of IL-1βand TGF-β1 was used to deal chondrocyte cell 48 hours.Then aggrecan and collagen II of those celluar and the control group were detected by immune-histochemistry. RT-PCR methondwas used to assessment celluar aggrecan and collagen II and aggrecanase-1，2 mRNA expressing.ResultsIL-1βincreases the expressing of aggrecanase-1，2 accordingly decrease the content of aggrecan， reduce the celluar character collagen II ，destroy the integrity of ECM. IL-1βhave negative effects on chondrocytes. Low-grade TGF-β1 have energetic effects on chondrocytes， altus improve the content of aggrecan also degration the aggrecan ，finally breakdown the balance of ECM， have negative effects on chondrocytes.

Key words：IL-1β; TGF-β1; chondrocytes

在整形外科領(lǐng)域，軟骨組織的缺損修復(fù)以及重建一直是一個難題。 組織工程概念的提出為整形外科領(lǐng)域提供了一種新的策略。將體外擴增的軟骨細胞接種至合適的支架材料上進行培養(yǎng)，以獲得組織工程軟骨。然而，體外擴增的軟骨細胞存在著去分化的現(xiàn)象，機制不明。細胞因子在影響細胞分化方面起著重要的作用，其中IL-1，TGF-β1的作用研究較多，但是各個學(xué)者看法不一。本文采用免疫組織化學(xué)染色， RT-PCR等方法探討IL-1β和TGF-β1對軟骨細胞Ⅱ型膠原，多聚蛋白聚糖酶-1，2(aggrecanase-1，2) 及蛋白多糖(aggrecan)表達量的影響。

1材料和方法

1.1 材料：體重約120g的雌性SD大鼠（由西安交通大學(xué)動物中心提供）。主要試劑與儀器：高糖 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（ Invitrogen公司）； 胰蛋白酶（Sigma公司）、透明質(zhì)酸酶、Ⅱ型膠原酶、阿爾新藍8GX（Sigma公司）；小鼠抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體（Neomarker公司）；羊抗大鼠aggrecan單克隆抗體 （Santa Cruz公司）；DAB免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉公司） ；RNA提取試劑盒（上海飛捷公司）；Revertaid First strand CDNA synthesic Kit(MBI)；正置、倒置相差顯微鏡及顯微攝影系統(tǒng)（Nikon）；二氧化碳培養(yǎng)箱等。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠肋軟骨細胞的分離培養(yǎng)[1]：SD 大鼠頸椎脫臼法處死，浸泡于70%的酒精中消毒15min。無菌操作臺中取其肋軟骨組織，剝離軟骨膜，之后放入10ml的螺口瓶中用眼科剪剪至1mm3左右的組織塊。采用三步法消化，獲得軟骨細胞， 37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)采用0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA（比例為1:1）進行消化，25㎝2培養(yǎng)瓶接種密度為105/ml。采用SP法進行蛋白多糖和II型膠原免疫組織化學(xué)染色，確認為軟骨細胞。本實驗所采用的是2代肋軟骨細胞。

1.2.2 不同濃度的IL-1β和TGF-β1作用于軟骨細胞：IL-1 β和TGF-β1分為以下濃度：1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml 。具體實驗步驟如下：①以5×104的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1.5ml含有不同濃度IL-1β、TGF-β1的培養(yǎng)液。每一濃度3孔，另設(shè)3孔對照。以1×105密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含有不同濃度IL-1β、TGF-β1的培養(yǎng)液。

1.2.3 免疫組化[2]：采用免疫組化二步法試劑盒。取2代80%融合軟骨細胞玻片，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3×3min；85%、95%和100%乙醇脫水，用中性樹脂將蓋玻片無細胞面貼在載玻片，風(fēng)干。0.3%H2O2室溫20min，PBS洗滌3×3min；加入一抗(稀釋度1:200)，4℃冰箱過夜，PBS洗滌3×3min；加入二抗為生物素化IgG(1∶400)，37℃30min， PBS洗滌3×3min；DAB顯色，常規(guī)封片。

1.2.4 RT-PCR檢測collagen II，aggrecanase-1，2及aggrecan的表達情況：用細胞刮刀刮下細胞，按RNA提取試劑盒說明提取總RNA。RT-PCR方法檢測不同濃度的IL-1β、TGF-β1作用后的軟骨細胞的collagen II，aggrecanase-1，2及aggrecan的mRNA 表達水平，同時用β-actin作為內(nèi)參對照(表1)。

逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的總體積為20μl。取3μl的cDNA進行PCR，其總體積為25μl[2]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。凝膠掃描分析目的基因灰度值，以β-actin為參照，計算相對OD值。相對OD值（%）=目的基因強度/β-actin 基因強度。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析：所有結(jié)果均采用x±ｓ表示，用 one-way Anova 分析比較組間差異，用統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析， 以P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察，肋軟骨原代細胞24h 貼壁，并有少量的細胞開始伸展，完全伸展的細胞呈現(xiàn)不規(guī)則的多角形，折光性強，約5～7天可鋪滿培養(yǎng)瓶進行傳代。傳代細胞約6h 就可貼壁且有細胞伸展的現(xiàn)象，約3～4天就可進行傳代。

2.2免疫組織化學(xué)染色觀察：不同濃度IL-1β作用后的軟骨細胞的蛋白多糖和膠原的表達量不同。隨著IL-1β濃度的增高，aggrecan、collagen II的含量明顯減少（圖1、2）。低濃度的TGF-β1作用后的軟骨細胞的蛋白多糖含量變化不大，高濃度的TGF-β1作用后的蛋白多糖含量高于對照組。TGF-β1作用后的細胞collagen Ⅱ的含量較對照組均有不同程度的降低，10ng/mlTGF-β1組降低的最為明顯（圖3、4）。

2.3 RT-PCR結(jié)果：隨著IL-1β濃度的增加，aggrecan，collagen II的含量明顯降低，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IL-1β作用后的軟骨細胞的aggrecanase-1，2 的表達比對照組高，但不成比例變化。以10ng/ml的IL-1β作用效果最強（圖5A）。

TGF-β1對軟骨細胞的作用沒有規(guī)律性，具體表現(xiàn)為：①隨著TGF-β1 濃度的增加，軟骨細胞aggrecan 的含量呈現(xiàn)增加的趨勢，但低劑量組（1ng/ml和10ng/ml）比對照組的含量低，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，100ng/ml組比對照組的含量略高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；② TGF-β1刺激后的軟骨細胞aggrecanase-2的含量比對照組多，以1ng/ml的最為顯著，而aggrecanase-1的含量變化比較復(fù)雜，由圖5B可見 1ng/ml 和10 ng/ml TGF-β1刺激組的aggrecanase-1的含量較對照組低，100 ng/ml TGF-β1刺激組的aggrecanase-1的含量則明顯高于對照組(P＜0.05) ；③各濃度的 TGF-β1作用后的細胞collagen Ⅱ的含量小于對照組，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3討論

軟骨組織是由細胞外基質(zhì)和包埋于其中的軟骨細胞組成。細胞外基質(zhì)是由高度水化的蛋白多糖和膠原分子組成。軟骨組織不像其他組織，其軟骨細胞并不是緊密相連，而是位于蛋白多糖形成的軟骨陷窩內(nèi)，借助于蛋白多糖獲取營養(yǎng)物質(zhì)及排出代謝產(chǎn)物，因此蛋白多糖在軟骨細胞的生長，分化和增殖中起著十分重要的作用。多聚蛋白聚糖酶主要是aggrecanase-1，2可以分解蛋白聚糖[3]，引起細胞外基質(zhì)的變化，從而影響細胞的生長和分化等。細胞外基質(zhì)中還存在著大量對細胞的生長、分化、代謝和凋亡進行調(diào)控的生長因子，如IL-1β，TGF-β1，ΒMP，F(xiàn)GF 等。一般認為IL-1β起著抑制軟骨細胞增殖的作用，ΒMP，F(xiàn)GF起促進軟骨細胞增殖的作用[4]。但是對于TGF-β1 對軟骨細胞所起的作用，各個學(xué)者意見不一。Denuziere A和 Morales TI 等認為TGF-β1可以促進蛋白質(zhì)的合成以及關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖[5-6]，在關(guān)節(jié)軟骨ECM的降解中起著非常重要的作用。De Haart 等[7]研究證實TGF-β1 可以促進原代及一代軟骨細胞的增殖，但是對第三代的軟骨細胞刺激作用減弱。

IL-1主要由單核細胞合成， 分子量為17KD的蛋白質(zhì)，有a，β兩種類型。IL-1a為酸性型，等電點為5.0，IL-1β為中性型，等電點為7.0。其中IL-1β是構(gòu)成細胞外基質(zhì)中IL-1的主要成份[8]。以往有研究表明IL-1β是一種負性調(diào)節(jié)因子，可以引起軟骨基質(zhì)的降解，促進軟骨的破壞。我們的實驗結(jié)果顯示IL-1β作用后的軟骨細胞aggrecan、collagen 的含量明顯比對照組少，而aggrecanase-1，2的含量比對照組高。說明IL-1β可以促進aggrecanase-1，2的表達，從而降低多聚蛋白聚糖的含量，破環(huán)細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，進一步影響細胞的生長，分化等；降低II型膠原的含量，使細胞呈現(xiàn)去分化的表現(xiàn)，這與Mathieu P等的研究結(jié)果一致[9]。

TGF-β1為 25KD的蛋白質(zhì)，由兩條肽鏈經(jīng)二硫鍵連接而成，是一種對多種類型的結(jié)締組織具有復(fù)雜生物學(xué)效應(yīng)的生長因子[10]，具有多重的生物學(xué)效應(yīng)。目前關(guān)于其對軟骨細胞的作用，尚無定論。有學(xué)者研究證實TGF-β1可以促進蛋白質(zhì)的合成[5]，促進關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖。Jong Eun Lee等研究證實含有TGF-β微球的殼聚糖支架材料與對照組（不含TGF-β）相比，能顯著促進細胞的增殖和多聚蛋白聚糖的合成[11]。陳百成等[12]認為TGF-β在軟骨細胞發(fā)育的不同階段起著不同的作用，對軟骨細胞的分化和功能具有雙向的調(diào)節(jié)作用。對未分化或者分化早的細胞，促進DNA的復(fù)制，II型膠原和多聚蛋白聚糖的合成[12-13]；對分化末期的細胞起著抑制軟骨細胞分化及軟骨基質(zhì)形成的作用[12]。Goto等將TGF-β1基因?qū)塍w外培養(yǎng)的軟骨細胞，發(fā)現(xiàn)膠原及非膠原蛋白、蛋白多糖的合成明顯增加[14]。 Border WA等認為TGF-β1在修復(fù)損傷的軟骨中起著重要的作用，但高劑量的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射可引起炎癥細胞的趨化作用，從而引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨缺陷處形成纖維樣組織，因此，應(yīng)該控制TGF-β1的用量以減小其副作用[15-16]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度TGF-β作用后的軟骨細胞分泌Collagen Ⅱ水平較對照組均有不同程度的降低。這一結(jié)果與Bradham DM 等的研究結(jié)果有一定的相似性[17]。Micky D等認為 aggrecanase-1在軟骨細胞基質(zhì)的降解中起著重要的作用，對蛋白多糖的降解負主要責(zé)任，而aggrecanase-2只是在病理情況下對蛋白聚糖的降解起輔助作用[18]。與對照組相比，1ng/ml和10ng/ml的TGF-β1減弱軟骨細胞aggrecanase-1，蛋白多糖的表達，增強aggrecanase-2的表達；100ng/ml的TGF-β1同時促進aggrecanase-1，2的表達，也促進aggrecan的表達。 100ng/ml組的aggrecanase-1，2的含量均高于正常對照組，且aggrecan 的含量也高于對照組，說明TGF-β1在增加aggrecanase-1，2的同時也增加蛋白多糖的表達， 對軟骨細胞起著雙重作用，與Βoumediene K 等的研究結(jié)果相同[19]。

組織工程軟骨的構(gòu)建需要大量的有功能的種子細胞，但在體外培養(yǎng)的過程中往往存在著細胞的去分化現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為隨著培養(yǎng)時間延長及傳代次數(shù)的增加軟骨細胞蛋白多糖和II型膠原含量逐漸減少。在培養(yǎng)的過程中加入細胞因子，促進軟骨細胞增殖的同時抑制多聚蛋白聚糖的降解，以維持軟骨細胞的表型，利于組織工程軟骨的構(gòu)建，是一個新的研究方向。本實驗從免疫組化，mRNA的水平分析了IL-1 β和TGF-β1對軟骨細胞的影響，為進一步研究軟骨細胞去分化奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2008-04-12[修回日期]2008-07-15

編輯/張惠娟