紅花龍膽總多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性檢測

朱淼，嚴凱，翁貴英，王緒英

（六盤水師范學院生物科學與技術學院，貴州六盤水553004）

紅花龍膽（Gentiana rhodantha Franch）為苗族常用藥材，在苗藥中被稱為“銳定謀”，是龍膽科龍膽屬多年生草本植物，同時也是2015版藥典中新增品種[1-2]。紅花龍膽主要分布于我國西南地區(qū)各省，全草可入藥，具有清熱利濕，消炎解毒的功效，被其生長地區(qū)的當?shù)鼐用裼糜谥委煼窝?、支氣管炎、眼結膜炎等炎癥以及痢疾、肺結核等感染，同時外用時還可治療癰癤瘡瘍，燒燙傷等癥，具有廣泛的藥理作用。

目前對于紅花龍膽化學成分報道較少。羅君等[3]通過超高效液相色譜-電噴霧質譜聯(lián)用技術對紅花龍膽95%醇提物的正丁醇萃取部位進行分析，共鑒定出環(huán)烯醚萜類、酚酸類、黃酮類、三萜類、苯甲酸碳苷類、吡喃酮類等共計33種化合物；陳云課題組[4]運用硅膠等多種色譜柱對紅花龍膽化學成分進行分離純化，得到并鑒定出10種酚類化合物和6種三萜類化合物共計16種物質。這些研究結果表明，紅花龍膽中主要的化學成分為萜類化合物和多酚類化合物。除了紅花龍膽的化學成分外，對于其生物活性也有所研究。方玉梅等[5]發(fā)現(xiàn)紅花龍膽對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制活性，而王飛清等[6]發(fā)現(xiàn)紅花龍膽對肺炎鏈球菌引起的肺炎具有防治作用。Kim課題組[7]研究發(fā)現(xiàn)，紅花龍膽可通過其中的Rhodanthpyrone A和Rhodanthpyrone B兩種化合物發(fā)揮抗炎作用，兩種物質能夠降低RAW 264.7細胞和巨噬細胞中一氧化氮合酶及環(huán)氧合酶2的表達，同時令炎癥細胞因子和趨化因子表達下調，并抑制了NF-κβ途徑。Xu等[8]的研究發(fā)現(xiàn)紅花龍膽中含有抑制乙酰膽堿酯酶的化學成分，提示紅花龍膽具有抗阿爾茨海默癥活性。

鑒于現(xiàn)在對紅花龍膽的生物活性研究報道較少，說明非常有必要對這種新增進入藥典的藥材做進一步研究，尤其目前對于紅花龍膽的抗氧化活性尚無報道。本研究針對紅花龍膽中一類主要的化學成分多酚類化合物進行提取，并利用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，同時考察多酚提取物的抗氧化活性，為紅花龍膽進一步的開發(fā)利用提供技術參考，同時為闡明紅花龍膽的抗氧化性提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花龍膽采于六盤水市，六盤水師范學院生物科學與技術學院植科教研室鑒定為龍膽屬植物紅花龍膽（Gentiana rhodantha Franch）的干燥莖葉；雙氧水：德州格利潔消毒制品有限公司；酒石酸鉀鈉、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、水楊酸、L-抗壞血酸、硫酸亞鐵、沒食子酸（均為國產(chǎn)分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波清洗機（SB-800DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司；中藥粉碎機（DFT-200）：海新諾儀器設備有限公司；電子天平（AUW120D）：日本島津公司；紫外分光光度計（UV-2100）：北京東西分析儀器有限公司；烘箱（HH-2A型）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

取新鮮紅花龍膽莖葉自然風干后，再放置60℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，待用。

1.3.2 標準曲線繪制

多酚含量測定采用酒石酸亞鐵顯色法[9]。取0.1250 g沒食子酸對照品加水定容至250 mL，配置成濃度為0.5 mg/mL 的對照品溶液，取該對照品 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 加入到 10 mL 容量瓶中，加水補至2 mL，再分別添加2 mL酒石酸亞鐵溶液后，用pH7.5的磷酸鹽緩沖液補齊至10 mL，放置室溫10 min后，在540 nm處測定吸光度。得到線性回歸方程y=14.13x-0.021 1（R2=0.998 5）。

多酚得率/%=提取液中多酚質量/莖葉干粉質量×100

1.3.3 樣品多酚提取流程

稱取0.5 g待測樣品，加入乙醇溶液，混勻后在超聲功率800 W的條件下進行多酚提取。將提取液以3 000 r/min離心5 min取上清。吸1 mL上清液至10 mL容量瓶內(nèi)，加水補至2 mL，再添加酒石酸亞鐵溶液2 mL，用pH7.5的磷酸鹽緩沖液定容至10 mL后混勻，靜置10 min，于540 nm處進行吸光度檢測。

1.3.4 單因素試驗

在料液比 1：60（g/mL），乙醇體積分數(shù) 50%時，檢測超聲時間為 10、20、30、40、50、60 min 時，紅花龍膽的多酚得率；在超聲時間 30 min，料液比 1：60（g/mL），檢測乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%時，紅花龍膽的多酚得率；在超聲時間30 min，乙醇體積分數(shù) 50%時，檢測料液比為 1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1 ∶80、1 ∶90（g/mL）時，紅花龍膽的多酚得率。以上所有條件保持超聲功率800 W不變。

1.3.5 響應面試驗

根據(jù)單因素（時間、料液比、乙醇體積分數(shù)）試驗結果，選取每個因素中對多酚得率影響較大的3個數(shù)值作為試驗因素，以多酚類化合物得率為響應值，根據(jù)Box-Behnken設計原理優(yōu)化紅花龍膽的多酚提取工藝，因素水平表見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.3.6 抗氧化試驗

將紅花龍膽多酚提取物稀釋成不同濃度后，進行羥自由基清除率[10]與超氧陰離子自由基清除率[11]檢測，并以VC做陽性對照。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲時間對多酚類化合物得率的影響

超聲時間對總多酚得率的影響見圖1。

圖1 提取時間對總多酚得率的影響Fig.1 Effect of exetraction time on the yield of polyphenols

由圖1可知，當超聲時間在30 min時，紅花龍膽的多酚得率達到最大，超過30 min后，得率有所下降，可能是由于隨著超聲時間的延長，一些熱敏組分被破壞，導致多酚析出量有所下降。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對多酚類化合物的影響

乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols

由圖2可知，當乙醇體積分數(shù)達到50%時，多酚類化合物的得率達到最大，隨著乙醇體積分數(shù)的進一步增加，多酚得率有所下降，可能是此濃度下的有機溶劑與紅花龍膽中的多酚極性比較接近，導致多酚類化合物析出量較多。

2.1.3 料液比對多酚類化合物得率的影響

料液比對多酚得率的影響見圖3。

圖3 料液比對多酚得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols

由圖 3 可知，在料液比 1 ∶60（g/mL）時，紅花龍膽多酚得率基本達到最大。隨著液體體積的增大，多酚得率基本不再增加，說明在料液比1∶60（g/mL）時紅花龍膽中多酚類化合物基本完全溶解。

2.2 響應面法分析結果

2.2.1 回歸模型的建立與分析

以紅花龍膽多酚得率為響應值，根據(jù)Box-Behnken原理設計三因素三水平響應面分析試驗，結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

得到各因素（多酚得率R、提取時間A、乙醇體積分數(shù)B、料液比C）擬合回歸方程：R=-45.454 00+0.257 80A+0.635 50B+1.036 85C+1.275 00×10-3AB-4.750 00×10-4AC-3.750 00×10-4BC-4.942 50×10-3A2-6.592 50×10-3B2-8.542 50×10-3C2。

根據(jù)上述回歸模型得到各項系數(shù)顯著性檢驗結果和方程方差分析結果，見表3。

表3 響應面試驗結果方差分析表Table 3 Analysis of variance of each term in the response surface regression model

該回歸模型具有極顯著差異（P=0.000 6＜0.01），其失擬項不顯著，表明該回歸模型與實測值之間具有較好的擬合度，其中A2、B2、C2對紅花龍膽多酚得率有極顯著的影響，C對紅花龍膽多酚得率有顯著影響。3個因素對紅花龍膽多酚得率的影響依次為C＞B＞A，即料液比＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間。

2.2.2 回歸模型響應面分析

通過Design-Expert對表2中的數(shù)據(jù)進行了三元二次回歸擬合后得到響應面圖，如圖4所示，AB、AC、BC響應面坡度平緩，說明他們之間的交互作用對紅花龍膽的多酚得率影響較弱。

圖4 各交互因素對多酚類化合物得率的影響Fig.4 Response surface plots of each pair of interaction factors on the extraction rate of polyphenols

2.2.3 工藝優(yōu)化驗證試驗

通過響應面分析后的優(yōu)化工藝為：提取時間29.62 min，乙醇體積分數(shù) 49.39%，料液比 1∶58.78（g/mL）時，紅花龍膽多酚得率為4.53%。為便于操作，將最優(yōu)工藝修正為：提取時間30 min，乙醇體積分數(shù)49%，料液比1∶59（g/mL），在此條件下，進行3次平行試驗，得到多酚的實際得率為4.61%，相對標準偏差為2.26%，與預測值4.53%的相對誤差為1.74%。

2.3 抗氧化活性檢測結果

羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率見圖5和圖6。

圖5 紅花龍膽多酚提取物和VC的羥自由基清除率Fig.5 Hydroxyl radical-scavenging activity of Gentiana rhodantha Franch and VC

圖6 紅花龍膽多酚提取物和VC的超氧陰離子自由基清除率Fig.6 Superoxide radical scavenging activity of Gentiana rhodantha Franch and VC

由圖5和圖6可知，隨著紅花龍膽多酚含量的不斷增加，提取物對羥自由基及超氧陰離子自由基的清除能力也逐漸增強，其線性擬合方程分別為：y（羥自由基）=186.7x-10.492，R2=0.995 7；y（超氧陰離子自由基）=187.85x-9.097 9，R2=0.996 1，均表現(xiàn)出良好的線性關系，其IC50分別為0.324 mg/mL和0.315 mg/mL。

3 結論

紅花龍膽作為一種地區(qū)性的民族用藥，現(xiàn)已開發(fā)了多種與之相關的復方配伍劑，本試驗通過超聲輔助提取其多酚類化合物，并采用響應曲面試驗確定其多酚提取的最佳工藝，并考察所得提取物的羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力。結果表明，最佳提取工藝為：在提取時間30 min，乙醇體積分數(shù)49%，料液比1∶59（g/mL）的條件下，紅花龍膽多酚得率為4.61%。其對羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的IC50分別為0.324mg/mL和0.315mg/mL，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。