響應面法優(yōu)化超聲輔助提取大果青扦葉總黃酮及其抗氧化性研究

李艷艷，王俊青，劉王文，陳壯，王曉歡

（1.平頂山學院，河南平頂山467000；2.平頂山市藥用植物功能成分利用工程技術研究中心，河南平頂山467000；3.河南省伏牛山區(qū)瀕危植物繁育工程技術研究中心，河南平頂山467000）

大 果 青 扦 （Picea neoveitchii） 隸 屬 于 松 科（Pinaceae）云杉屬（Picea）植物，國家二級保護植物，為我國特有珍稀瀕危植物，與青扦（Picea wilsonii）相比，葉片形態(tài)差異明顯，大果青扦果實也相對較大。大果青扦主要分布在湖北西部、陜西秦嶺和甘肅天水及白龍江流域，是集用材、藥用、觀賞和生態(tài)于一體的優(yōu)良植物[1-2]。國內(nèi)外學者分析大果青扦的表達序列標簽-簡單重復序列標記[3]，葉綠體基因組序列[4]，大果青扦、秦嶺冷杉和太白紅杉的生存環(huán)境影響因子[5]，種子的萌發(fā)及種群的動態(tài)特征分析[1]以及其含有的黃酮及黃酮的結構與抗菌活性、細胞毒性[6]等進行了研究。Chen等[6]從大果青扦枝葉里分離出來8種化合物，其中C-甲基化的云杉黃酮苷，有抗真菌活性、細胞毒性等作用。隨后又在云杉屬葉片黃酮、多酚含量以及抗氧化性有研究報道[7-9]，黃酮類物質(zhì)具有保肝、抗衰老、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、治療心血管系統(tǒng)疾病等作用[10-16]，但對大果青扦葉中黃酮提取工藝及抗氧化活性研究鮮見報道。超聲波輔助提取是利用超聲波具有的機械效應、空化效應和熱效應，通過增大介質(zhì)分子的運動速度、增大介質(zhì)的穿透力以提取生物有效成分。超聲輔助提取黃酮類化合物，操作簡單、成本低、時間短、提取率高，目前應用較多。本研究通過單因素試驗和響應面分析法，優(yōu)化篩選超聲輔助提取大果青扦葉總黃酮的最優(yōu)提取工藝并對其DPPH自由基，ABTS+自由基和亞硝酸鹽的清除能力進行研究，以期為大果青扦葉黃酮資源的利用和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

大果青扦葉取自湖北襄陽，將其置于50℃的電熱鼓風干燥箱中烘4 d后，經(jīng)粉碎機粉碎過60目篩網(wǎng)留以備用。

1.2 試劑與儀器

蘆丁標準品、二苯基苦基肼自由基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]：天津光復精細化工研究所；三羥甲基氨基甲烷、抗壞血酸（vitamin C，VC）、無水乙醇、亞硝酸鈉、六水三氯化鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

DR6000紫外可見分光光度計：哈希（上海）儀器有限公司；H2050R高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Q20真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長科工貿(mào)有限公司；101-1-BS電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；KQ-200VDE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 蘆丁標準曲線的繪制

參照李柏和王俊青等[17-18]的方法稍加改進，配置成2 mg/mL蘆丁標準溶液為橫坐標（X）在波長506 nm處測定其吸光度A值，以吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線。標準曲線方程為：Y=0.334 5X+0.023，R2=0.999。

1.4 提取工藝

精密稱取2.0 g的大果青扦粉末，按一定液料比、乙醇濃度、超聲功率、提取溫度、超聲時間、提取次數(shù)，用薄膜包封超聲輔助提取，將其溶液搖勻，進行離心，離心速度為4 000 r/min，離心25 min，再取上清液定容，然后加入同等濃度乙醇并定容至刻度線，搖勻。后續(xù)操作按照1.3中的步驟，取樣加顯色劑，平行測定數(shù)值3次。

總黃酮提取率的計算公式：

式中：E為總黃酮提取率，mg/g；c為根據(jù)標準曲線回歸方程求出的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液的稀釋倍數(shù)；v為離心液定容的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.5 響應面優(yōu)化提取工藝

通過單因素的試驗結果可以看出液料比和提取次數(shù)對于總黃酮提取率的影響因素較少，所以確定液料比 40 ∶1（mL/g），提取次數(shù) 2 次，采用 Design-Ex－pert8.0.6軟件（Stat-EaseInc，USA），選擇乙醇濃度、提取溫度、超聲功率和超聲時間4個影響因素，根據(jù)表1的響應面Box-Benhnken設計因素與水平，優(yōu)化大果青扦葉總黃酮的超聲輔助提取工藝。

表1 響應面分析法因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface methodology

1.6 體外抗氧化研究

1.6.1 DPPH自由基清除作用

參照楊永濤[19]的方法配制出各個梯度的樣品溶液進行自由基清除。取樣品溶液2mL和DPPH溶液2mL，搖勻混合，靜置反應30 min后，以無水乙醇調(diào)零，在517 nm波長處測定吸光度記為A0；再取無水乙醇2 mL和DPPH溶液2 mL，搖勻混合，靜置反應30 min后，以無水乙醇調(diào)零，在517 nm波長處測定吸光度記為A1；再取樣品溶液2 mL和無水乙醇2 mL，搖勻混合，靜置反應30 min后，以無水乙醇調(diào)零，在517 nm波長處測定吸光度記為A2；以抗壞血酸（VC）溶液作陽性對照。采用公式 DPPH 自由基清除率/%={[A2-（A1-A0）]/A2}×100，計算DPPH自由基的清除率。

1.6.2 ABTS+自由基的清除作用

取ABTS溶液（7 mmol/L）、過硫酸鉀溶液各20 mL，按照1∶1體積比混合均勻，避光放置12 h后留做混合液。取混合液，在734 nm處測量吸光度。然后用無水乙醇調(diào)節(jié)吸光度為0.70±0.02，ABTS工作液配制完成（ABTS工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用）。取0.4 mL樣品溶液，加入ABTS工作液4.0 mL，靜置反應5 min，以無水乙醇調(diào)零，在734 nm處測得吸光度A1。再取0.4 mL蒸餾水，加入ABTS+自由基工作液4.0 mL，靜置反應5 min，以無水乙醇調(diào)零，在734 nm處測得吸光度A0。以抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對照，采用公式ABTS+自由基清除率/%=[（A0-A1）/A0]×100，計算ABTS+自由基的清除效果。

1.6.3 亞硝酸鹽的清除作用

根據(jù)張靈幫等[20]的方法再稍加改進，于波長538 nm處測定其吸光值記為A1，以蒸餾水作為空白組，測得吸光值記為A2，沒有加入鹽酸萘乙二胺溶液測定的吸光值記為A0。以抗壞血酸（VC）溶液作為陽性對照，采用公式亞硝酸鹽清除率/%=[A2-（A1-A0）]/A2×100，計算亞硝酸鹽清除率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對總黃酮提取率的影響

液料比對總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction of total flavonoids

分別采用液料比為 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50∶1（mL/g）進行超聲輔助提取，設定提取溫度45℃、超聲功率320 W、超聲時間30 min、乙醇濃度50%、提取次數(shù)為1次，測定黃酮的提取率。如圖1所示，增加乙醇用量，總黃酮提取率隨著升高；當液料比達到40∶1（mL/g）時，提取率為8.35%；繼續(xù)增加乙醇溶液的用量，黃酮的提取率變化不明顯，這可能是隨著溶劑的增加，導致其他雜質(zhì)也被提取出來，從而使黃酮的溶解度降低，提取率減少[21]。故后續(xù)響應面分析法試驗均采用最佳液料比為 40 ∶1（mL/g）。

2.1.2 提取溫度對總黃酮提取率的影響

提取溫度對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extractive temperature on extraction of total flavonoids

分別采用提取溫度 35、45、55、65、75 ℃ 進行超聲提取，設定超聲功率320 W、超聲時間30 min、液料比40 ∶1（mL/g）、乙醇濃度 50%、提取次數(shù)為 1 次，測定黃酮的提取率。由圖2所示，提取溫度逐漸升高，總黃酮提取率得到了大幅度提升，提取溫度45℃～55℃之間，總黃酮提取率增加緩慢，在55℃時提取率達到最大；繼續(xù)升高提取溫度，使黃酮部分結構被破壞，從而使提取率降低[22]。所以總黃酮提取時最佳提取溫度為55℃。

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對總黃酮的提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對總黃酮的提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction of total flavonoids

分別采用乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%進行超聲輔助提取，設定提取溫度45℃、超聲功率 320 W、超聲時間 30 min、液料比 40 ∶1（mL/g）、提取次數(shù)為1次，測定黃酮的提取率。由圖3結果可知，當乙醇濃度為50%時，提取率為8.05%，達到最高。所以總黃酮提取時最佳乙醇濃度為50%。

2.1.4 超聲時間對總黃酮提取率的影響

超聲時間對總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對總黃酮的提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction of total flavonoids

分別采用超聲時間為 20、40、60、80、100、120 min進行超聲輔助提取，設定提取溫度45℃、超聲功率320 W、液料比 40∶1（mL/g）、乙醇濃度 50%、提取次數(shù)為1次，測定黃酮的提取率。由圖4結果可知，當超聲時間為60 min時，提取率達到10.28%，達到最大。超過60 min，黃酮的結構可能隨著超聲時間的延長而遭到氧化破壞，從而使總黃酮提取率降低[22]，所以總黃酮提取時最佳超聲時間為60 min。

2.1.5 超聲功率對總黃酮提取率的影響

超聲功率對總黃酮的提取率的影響見圖5。

圖5 超聲功率對總黃酮的提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction of total flavonoids

分別采用超聲功率為240、320、400、480、560 W進行超聲輔助提取，設定提取溫度45℃、超聲時間30 min、液料比 40 ∶1（mL/g）、乙醇濃度 50%、提取次數(shù)為1次，測定總黃酮的提取率。如圖5所示，超聲功率為480 W時，總黃酮的提取率為9.91%，達到最大。而超聲功率再增大時，過大的超聲功率造成黃酮結構被破壞，從而使總黃酮的提取率降低[23]，所以總黃酮提取時最佳超聲功率為480 W。

2.1.6 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響

提取次數(shù)對總黃酮的提取率的影響見圖6。

圖6 提取次數(shù)對總黃酮的提取率的影響Fig.6 Effect of extraction times on extraction of total flavonoids

分別采用1、2、3次進行超聲輔助提取，設定提取溫度55℃、超聲功率320 W、超聲時間30 min、液料比40∶1（mL/g）、乙醇濃度50%，測定總黃酮的提取率。如圖6所示，在提取次數(shù)為2次時，提取率為9.53%，提取率達到最大。提取次數(shù)過多，耗時較長，且浪費試劑，故后續(xù)響應面分析法均采用超聲輔助提取2次。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面分析

通過單因素試驗結果，確定響應面法試驗設計的因素和水平，即選取4個因素，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設計原理[24-25]，試驗設計方案和結果見表2。

表2 響應面設計方案與結果Table 2 The program and experimental results of response surface methodology

續(xù)表2 響應面設計方案與結果Contimue table 2 The program and experimental results of response surface methodology

以各因素為自變量，利用軟件DPS8.06進行結果分析。以總提取率為指標進行二次多項式逐步回歸分析，得到的總黃酮提取率（Y）對A、B、C、D回歸數(shù)學模型為：Y=12.04+0.16A-0.098B-0.31C+0.048D-0.048AB+0.077AC+0.12AD-0.32BC+0.22BD-0.072CD-0.52A2-0.28B2-0.46C2-0.87D2。

對上述模型進行方差分析，見表3。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

續(xù)表3 回歸方程方差分析表Contimue table 3 Variance analysis of mathematical regression model

模型F值為10.47意味著模型具有重要意義。模型P＜0.000 1，回歸方程具有顯著性，可以對試驗結果進行分析，并進一步對回歸方程各項做顯著性檢驗。其中，提取溫度（C），超聲時間的二次項（A2），提取溫度的二次項（C2），乙醇濃度的二次項（D2）的P值均小于0.01，表明對總黃酮提取率影響極顯著；超聲時間（A），超聲功率和提取溫度的交互項（BC），超聲功率的二次項（B2）均大于0.01小于0.05，表明對總黃酮提取率影響顯著。模型失擬項P＞0.05，表明模型誤差小。在所選因素結果中的影響排序：提取溫度＞超聲時間＞超聲功率＞乙醇濃度。

利用響應面曲面圖來反映各因素之間的兩兩交互對大果青扦葉黃酮提取率的影響，圖7為四因素交互作用的響應面圖。響應值受曲線走勢影響，即越陡的曲線走勢，對總黃酮的提取率影響越大；越平滑的的曲線走勢，對總黃酮提取率的影響越小[26]。乙醇濃度和提取溫度對總黃酮提取率的影響較大，因為其曲線趨勢較陡；超聲功率和超聲時間對其影響較小，因為其曲線走勢較平緩。

圖7 四因素交互作用對大果青扦葉總黃酮提取率的影響Fig.7 Effects of interaction between four factors on total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

2.2.2 驗證試驗

根據(jù)試驗條件，經(jīng)軟件分析得最優(yōu)工藝條件是：超聲時間62.56 min，超聲功率481.98 W，提取溫度51.67℃，乙醇濃度50.63%，提取率可達12.10%。結合實際應用，各工藝條件可調(diào)整為超聲時間63 min，超聲功率480 W，提取溫度52℃，乙醇濃度50%，此時提取率為12.12%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）=0.30%，與理論值接近，表明該模型得到的工藝條件準確可靠。

2.3 大果青扦葉總黃酮體外抗氧化

2.3.1 清除DPPH自由基活性

取大果青扦葉總黃酮，研究各濃度梯度總黃酮提取液和陽性對照VC對DPPH自由基的清除率，大果青扦葉總黃酮對DPPH自由基的清除率見圖8。

由圖8可知，在相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大果青扦葉總黃酮及VC對DPPH自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，其中對DPPH自由基清除率的最大值達到50.55%。經(jīng)線性擬合，大果青扦葉總黃酮對DPPH自由基的半抑制濃度（IC50）值為1.05 mg/mL。

2.3.2 清除ABTS+自由基活性

大果青扦葉總黃酮對ABTS+自由基的清除率見圖9。

圖8 大果青扦葉總黃酮對DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Effect on DPPH free radical scavenging rates of total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

圖9 大果青扦葉總黃酮對ABTS+自由基清除率的影響Fig.9 Effect on ABTS+free radical scavenging rates of total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

由圖9可知，隨著大果青扦葉總黃酮質(zhì)量濃度由0.02 mg/mL增加到0.08 mg/mL，其對ABTS+自由基的清除率增強，總黃酮質(zhì)量濃度在0.08 mg/mL，清除率達到96.06%，后續(xù)隨著濃度增大清除率增加幅度變緩，表明大果青扦葉總黃酮ABTS+自由基的清除能力與濃度存在量效關系。而陽性對照VC溶液在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除率趨近100%，說明VC對ABTS+自由基的清除效果更好。大果青扦葉總黃酮對ABTS+自由基的IC50值為0.035 mg/mL。

2.3.3 清除亞硝酸根活性

大果青扦葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除率見圖10。

圖10 大果青扦葉總黃酮對亞硝酸鹽的清除率Fig.10 Nitrite scavenging rates of total flavonoids from leaves of P.neoveitchii

由圖10可知，在相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著VC和大果青扦葉總黃酮質(zhì)量濃度的增加，對亞硝酸鹽的清除率也在不斷增加，在質(zhì)量濃度達到3.0 mg/mL時，其清除率達到64.31%，說明大果青扦葉總黃酮的清除能力與濃度呈明顯的正相關關系，其亞硝酸根的清除率與黃瑾葉總黃酮（3.0 mg/mL時清除率約69.58%）類似[27]。大果青扦葉總黃酮對亞硝酸鹽的IC50值為1.98 mg/mL。

3 結論

本研究根據(jù)響應面法得到大果青扦葉總黃酮最佳超聲輔助提取工藝：液料比40∶1（mL/g），超聲時間63 min，超聲功率 480 W，超聲溫度52℃，乙醇濃度50%，提取次數(shù)2次，提取量為121.18 mg/g。在體外大果青扦葉總黃酮對DPPH自由基、ABTS+自由基和亞硝酸鹽表現(xiàn)出較好的清除效果，其總黃酮的抗氧化活性與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)量效關系。本研究的結果以期為大果青扦的利用和開發(fā)提供依據(jù)。