流式細胞術(shù)在體育科研中的應(yīng)用

李松波　金衛(wèi)東　王　雋　張愛芳

摘 要：流式細胞術(shù)是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、流體力學(xué)、電子計算機、細胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù),對高速流動的細胞或亞細胞進行快速定量測定和分析的方法。用它不僅可以來對細胞進行計數(shù)，還可以對細胞的混合物進行細胞類型的分析研究，并同時測定細胞的多個參數(shù),如測定細胞的特征(形態(tài)、膜電位等)和細胞內(nèi)pH,細胞DNA、蛋白質(zhì)含量、表面受體、Ca2+等。流式細胞術(shù)分析細胞的靈敏度、精密度大大超越了傳統(tǒng)的技術(shù)，因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)等許多領(lǐng)域。主要綜述流式細胞術(shù)在體育科研中的應(yīng)用并討論它在應(yīng)用中的局限性和面臨的挑戰(zhàn)。

關(guān)鍵詞：流式細胞術(shù);免疫功能;細胞凋亡;綜述

中圖分類號：G804.7

文獻標(biāo)識碼：B

文章編號：1007-3612(2008)08-1102-03

Application of Flow Cytometry in Sports Research

LI Song-bo1, JIN Wei-dong2, WANG Jun3, ZHANG Ai-fang1

(1.Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 2.Hebei University of Technology, Langfang 065000, Hebei China;

3.Capital Institute of Physical Education, Beijing 100084, China）

Abstract:Flow cytometry is a method for rapidly analyzing large numbers of cells individually using light fluorescence and integrating optics, fluidics, electronics, and computer technology. Now it is a powerful tool for characterizing the composition of complex cell populations. Flow cytometric assays have been developed to determine both cellular characteristics such as size, membrane potential, and intracellular pH

and the levels of cellular components such as DNA, protein, surface receptors, and calcium. The accuracy and precision of this technology for describing and enumerating cells exceeds traditional methods. With its high sensitivity and specificity, the flow cytometric has become the preferred method for the lineage assignment and maturational analysis of m alignant cells in acute leukemia and lymphoma。Flow cytometry has revolutionized the field of immunology, in both the basic science and clinical settings, as well as having been instrumental to new and exciting areas of discovery such as stem cell biology and detecting microorganisms in environmental samples. This review focuses primarily on the use of flow cytometry in sport research area. Finally, a discussion of the challenges and limitations of the method is presented along with a future outlook.

Key words: flow cytometry; immune function; apoptosis; review

流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，簡稱FCM）是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項新技術(shù),它是利用流式細胞儀測量在液流中細胞或顆粒懸液中的標(biāo)記物熒光強度并進行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。已經(jīng)在細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用；并已廣泛應(yīng)用于體育科研領(lǐng)域中，主要有運動與免疫功能、運動與細胞凋亡和運動相關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物免疫標(biāo)記的檢測等方面。

1 FCM基本原理

FCM的基本原理是將待測樣本的細胞懸液，在鞘液的包圍和約束下，使細胞排成單列由流動室噴嘴高速噴出，形成細胞液柱，當(dāng)液柱通過檢測區(qū)，在入射的激光束照射下產(chǎn)生前向散射光(FCS)和側(cè)向散射光(SSC)，它們分別反映細胞的大小和顆粒度，根據(jù)這些特性可將細胞分類。同時經(jīng)一種或幾種特殊熒光標(biāo)記的樣本細胞，在激光束的激發(fā)下產(chǎn)生特定熒光，該熒光信號可被光學(xué)系統(tǒng)檢測并輸送到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析。

2 FCM在體育科研中的應(yīng)用

2.1 運動與外周血白細胞的免疫表型分析 細胞免疫表型的研究是FCM應(yīng)用最成熟的領(lǐng)域之一。運動影響外周血白細胞的免疫表型的研究基本集中在T淋巴細胞、NK細胞等在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較早的細胞上。大量研究表明T淋巴細胞在不同的CD4和CD8群中，表面標(biāo)記與功能的關(guān)系存在普遍的規(guī)律，這也正是利用T淋巴細胞的免疫表型來分析其功能的理論基礎(chǔ)。運動對T淋巴細胞的影響研究很多。研究發(fā)現(xiàn)，一次比賽或訓(xùn)練前、即刻、和之后24 h CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺和CD¹⁹⁺等一般會有一個升高、降低并恢復(fù)的過程^［1］,長時間大強度訓(xùn)練會導(dǎo)致外周血CD⁴⁺比例下降，CD⁸⁺比例上升，CD⁴⁺/CD⁸⁺比值下降，NK細胞活性下降^［2］。其中，運動強度是影響運動過程中NK細胞變化的關(guān)鍵因素,運動強度愈大NK細胞的變化愈明顯,主要表現(xiàn)為外周血NK細胞數(shù)量與功能的下降^［3］。近幾年研究表明，高原訓(xùn)練及低氧暴露可抑制機體免疫功能^［4］。王恬等研究發(fā)現(xiàn)不同的模擬低氧訓(xùn)練過程中,淋巴細胞及其亞群(CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺T)的變化總體趨向較為一致,但變化程度有所差異。低氧訓(xùn)練第4周、第5周, HiHiLo組NKT(Natural killer T)細胞下降幅度更大；低氧訓(xùn)練第5周CD³⁺、CD⁴⁺均呈上升趨勢,但LoHi組上升更明顯^［5］。

運用FCM研究營養(yǎng)補劑調(diào)節(jié)運動導(dǎo)致的免疫功能抑制時發(fā)現(xiàn)，運動員通過長期低劑量口服補充谷氨酰胺、補充牛初乳、服用黃芪多糖和牛膝多糖能有效防止訓(xùn)練期后CD⁴⁺/CD⁸⁺比值的下降，抑制淋巴細胞數(shù)量的減少和活化T細胞數(shù)量的下降^［6］。

可見利用FCM監(jiān)測T淋巴細胞變化的幅度可以反映運動員的疲勞程度，對訓(xùn)練的適應(yīng)及恢復(fù)情況；所以，在大負荷訓(xùn)練期必須重視運動員免疫機能的變化，積極采取措施預(yù)防疾病的發(fā)生、發(fā)展。

2.2 運動對紅細胞的影響分析 FCM在紅細胞中的最大應(yīng)用價值是其能檢測少量紅細胞群體。朱榮等研究HiHiLo對足球運動員紅細胞的影響發(fā)現(xiàn)HiHiLo和LoLo均可下調(diào)人體紅細胞CD58、CD59（熒光強度）表達, HiHiLo影響紅細胞CD58表達下降較LoLo有更明顯趨勢，從而影響紅細胞對T淋巴細胞免疫的調(diào)控^［7］。HiLo實驗中靈芝多糖可以明顯影響紅細胞CD35數(shù)量的表達,并且可以調(diào)節(jié)實驗中出現(xiàn)的運動員紅細胞繼發(fā)性免疫低下的現(xiàn)象。曹建民等研究表明運動訓(xùn)練導(dǎo)致運動性貧血大鼠紅細胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量明顯增加,且與血清鐵呈高度相關(guān),說明紅細胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量能更為準(zhǔn)確地反映紅細胞內(nèi)和機體鐵代謝狀況，同時發(fā)現(xiàn)抗貧血鐵制劑復(fù)合營養(yǎng)補劑的干預(yù)能顯著降低紅細胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量^［8］。

2.3 運動對網(wǎng)織紅細胞的影響分析 前已述及，由于激光束可射入細胞內(nèi)，因而可進行紅細胞內(nèi)容物的分析，網(wǎng)織紅細胞漿內(nèi)含有一定量的 RNA，經(jīng)染色后可顯示網(wǎng)織結(jié)構(gòu)且其形式與 RNA 含量有關(guān)。這樣用FCM測定網(wǎng)織紅細胞,根據(jù)熒光強度將其分為低、中、高(LFR,MFR, HFR)三種熒光類型；幼稚網(wǎng)織紅細胞有最強的熒光，多為MFR，HFR；較成熟的熒光強度弱，為LFR。在造血受到刺激，幼稚的從骨髓釋放入外周血MFR, HFR顯著增高，即未成熟網(wǎng)織紅細胞指數(shù)(IRF)顯著增高^［9］，往往提示紅細胞生成開始。所以此方法可及時的反映骨髓的造血狀況,其在監(jiān)測紅細胞生成和破壞,監(jiān)測體內(nèi)鐵的存儲形式和利用情況,及補充鐵劑的效果時,均可提供及時可靠的信息，對運動性貧血的診斷、鑒別診斷和療效觀察有重要意義。

運用FCM研究不同項目運動員網(wǎng)織紅細胞參數(shù)時發(fā)現(xiàn), 表現(xiàn)性項群運動員LFR最高，而RET%和MFR比例卻顯著低于耐力性項群、速度力量性項群和對抗性項群。提示表現(xiàn)性項群網(wǎng)織紅增生活性較低。4個項群中,對抗性項群運動員Hb最低,網(wǎng)織紅細胞參數(shù)中CHr及網(wǎng)織紅細胞內(nèi)血紅蛋白量濃度（HDWr）顯著低于其它項群運動員^［10］。

許多研究表明低氧訓(xùn)練時的Hb的變化與RET有很高的相關(guān)性^［11］。劉媛媛等研究了13名國家女子中長跑隊運動員RET在26d的低氧訓(xùn)練的變化發(fā)現(xiàn)， HiHiLo組的IRF、RMI以及Hb、RET%的增加幅度均高于LoHi組同時段各指標(biāo)；并且受檢網(wǎng)織紅細胞參數(shù)反映骨髓紅系增生的敏感性依次為IRF=RMI>RPI=RET%和RET%>Hb^［12］。張春麗等還發(fā)現(xiàn)模擬HiLo的大鼠高強度定量負荷組與極限負荷組的RET%顯著低于常氧組。兩氧環(huán)境中,高強度定量負荷組RET%顯著低于運動后40h安靜組^［13］。但Ashenden M J等對澳大利亞國家女自行車運動員為期70d的高住(海拔高度2 650 m)低練的研究結(jié)果表明,對RET和Hb沒有顯著意義^［14］。Lundby等對8名運動員模擬高原(4 100 m)的低氧艙中為期14d的間歇性低氧訓(xùn)練后,RET還包括EPO、Hb和HCT無明顯改變^［15］。產(chǎn)生這種不同的研究結(jié)果，除有運動項目自身的因素外，研究時還要考慮網(wǎng)織紅細胞變化先于Hb的特點。因為有人動態(tài)觀察顯示HFP(早期網(wǎng)織紅細胞)比率的升高可早于Hb變化3～5 d，早于MCV變化5～7 d^［16］。

2.4 運動與血小板相關(guān)免疫球蛋白和血小板微粒膜蛋白分析 血小板功能變化是血栓形成的病理過程的重要因素。FCM已經(jīng)成為檢測血小板功能狀態(tài)的重要實驗手段,因為它有助于區(qū)分血小板病理學(xué)形態(tài)變化和膜蛋白分析；可以研究不同誘導(dǎo)劑作用下、剪切力誘導(dǎo)下血小板活化時其鈣離子濃度的變化，檢測活化血小板，血小板缺陷性、減少性疾??；檢測網(wǎng)織血小板（RP）可用于發(fā)生栓塞的危險性判斷。

運動作為一種預(yù)防高血壓患者血栓性疾病發(fā)生的手段,已為人們所接受并在實踐中廣泛應(yīng)用, 竇麗等研究發(fā)現(xiàn)進行10周中等強度的游泳運動能提高高血壓大鼠血小板內(nèi)NOS活性,增加血小板NO的釋放,提高血小板內(nèi)cGMP水平來抑制血小板的聚集,對防治高血壓血栓性疾病有重要的作用^［17］。研究還有長期規(guī)則游泳運動對Wistar大鼠血小板L-Arg轉(zhuǎn)運的影響,結(jié)果表明,適宜運動可提高血小板L-Arg（L-精氨酸）轉(zhuǎn)運率,據(jù)此推測運動可通過增加L-Arg的轉(zhuǎn)運,促進血小板NO的合成和釋放,以負反饋方式抑制血小板的聚集,從而對預(yù)防血管栓塞性疾病有積極的作用^［18］。研究表明早期康復(fù)訓(xùn)練可下調(diào)急性腦梗死（ACI）早期血小板活化及血小板胞漿內(nèi)-α粒膜上糖蛋白CD62P的表達^［19］。

2.5 用于細胞凋亡的檢測 細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序性的死亡。近年來研究多用FCM來檢測細胞凋亡，包括凋亡DNA的檢測、細胞質(zhì)膜的完整性、線粒體跨膜電位、溶酶體質(zhì)子泵、蛋白質(zhì)和DNA含量、光的散射、DNA的原位降解、細胞凋亡的定量測定等。FCM常用于凋亡檢測的方法有Caspase-3、Annexin V和DNA斷裂片段的分析等方法，其中Annexin V聯(lián)合PI法是一種新的較為理想的檢測方法。

FCM在運動與淋巴細胞凋亡研究中的應(yīng)用。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)小負荷運動不影響淋巴細胞的凋亡^［20］；有趣的是有研究發(fā)現(xiàn)，中等負荷運動訓(xùn)練可以降低心理應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠外周血淋巴細胞凋亡量，降低心理應(yīng)激對大鼠機體免疫功能的危害^［21］。大負荷運動會導(dǎo)致運動后血液中淋巴細胞的凋亡，王安利較全面地研究了不同負荷對小鼠淋巴細胞凋亡的影響， 發(fā)現(xiàn) 6月齡小鼠、12月齡小鼠淋巴細胞凋亡的發(fā)生率由高到低，其排列順序依次是，負重運動組>一次性力竭運動組>對照組>無負重組^［22］。

FCM在運動與骨骼肌細胞凋亡研究中的應(yīng)用。Biral等研究發(fā)現(xiàn)成年小鼠經(jīng)過12 h的鋼籠內(nèi)自發(fā)跑后，運動后即刻肌細胞凋亡率最高，6 h后稍微有所下降，96 h后凋亡率大幅度下降^［23］。越來越多的證據(jù)表明，運動訓(xùn)練導(dǎo)致的肌肉細胞凋亡有一定的時相性和矛盾性,運動可以導(dǎo)致骨骼肌細胞凋亡,但是運動本身對已經(jīng)凋亡骨骼肌細胞可能具有清除作用或?qū)磳⒌蛲龅墓趋兰〖毎谢謴?fù)作用，這兩種作用結(jié)果之間調(diào)控失衡，可能是造成骨骼肌運動損傷原因之一，說明運動影響骨骼肌細胞的凋亡具有雙向性^［24］。

許多研究采用FCM檢測大鼠各組心肌、腎組織細胞和肝細胞凋亡率的變化發(fā)現(xiàn)運動可以誘導(dǎo)肝細胞凋亡、心肌細胞凋亡，且隨運動強度增加而增加^［25］。金其貫等研究還發(fā)現(xiàn)力竭后即刻心肌細胞凋亡與腎細胞凋亡率即明顯升高; 之后的24 h之內(nèi),它們會有一個明顯升高然后降低的過程但仍明顯高于對照組^［26］。還有研究發(fā)現(xiàn)補充銀杏制劑、膽紅素可通過其抗氧化作用及影響凋亡相關(guān)基因的表達而抑制大強度運動訓(xùn)練誘導(dǎo)的肝、心肌細胞過度凋亡，從而發(fā)揮一定的保護作用^［27］。

總之，F(xiàn)CM不僅為細胞是否發(fā)生凋亡提供客觀證據(jù)，而且還能對細胞凋亡進行定量分析，并可從多方面證實細胞凋亡和細胞壞死的區(qū)別，同時還能檢測同一群體的不同亞群細胞中的凋亡細胞，并可進行分選。

2.6 用于檢測與運動能力相關(guān)基因的表達產(chǎn)物 FCM在此方面的研究國內(nèi)未見報道，它的優(yōu)勢在于不必分離蛋白質(zhì)就可以對細胞膜表面、細胞漿中的蛋白質(zhì)進行分析檢測。如近幾年的研究熱點淋巴細胞的細胞因子（γ-INF、α-TNF）的分泌^［28］。Staats R等為了解劇烈運動后運動員體內(nèi)NK細胞毒活性(NKCA)和淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)抑制的原因,研究了淋巴細胞亞群改變和細胞內(nèi)穿孔素（PFR）基因表達改變的相關(guān)性,使用流式細胞儀對PFR進行了分析。他們發(fā)現(xiàn):訓(xùn)練有素的運動員外周血中PFR的百分比相對較高,但在過度疲勞后PFR出現(xiàn)暫時性下降^［29］。

3 FCM在體育科研應(yīng)用中存在的問題

綜上所述，F(xiàn)CM以其快速、準(zhǔn)確、靈活、多參數(shù)同時分析等優(yōu)點,已成為體育科研的重要方法之一。但其中也存在以下問題：1）聯(lián)用抗體對運動影響人體免疫細胞功能的組合設(shè)計處于初級階段。FCM對臨床白血病和淋巴瘤等疾病的診斷已有多種成熟的抗體“組合”方式；但關(guān)于運動對人體免疫細胞影響的研究還多停留在T細胞亞群水平，并沒有形成比較成熟的抗體組合（沒有系統(tǒng)的CD研究方案）。2）通常檢測的是外周血標(biāo)本，更應(yīng)考慮留取其他標(biāo)本（如骨髓、淋巴節(jié)、胸腔液、腹腔液或腦脊液）。因為這樣才有可能及時、準(zhǔn)確、全面地反映機體功能的變化，但這些樣本不易從健康個體獲取。3）應(yīng)加強研究不同訓(xùn)練負荷量和不同補劑對血小板功能、粒細胞功能的影響，為運動疾病的防治提供理論依據(jù)。4）加強質(zhì)量控制，一些FCM檢測技術(shù)在方法學(xué)和抗體選擇上還沒有統(tǒng)一,分析結(jié)果亦存在多種影響因素,如樣本與試劑準(zhǔn)備、免疫熒光染色方法、對照設(shè)置、流式細胞數(shù)據(jù)的獲取與分析等。只有充分了解這些影響因素,建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序并做好嚴(yán)格的質(zhì)控,才能保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。相信,隨著FCM的不斷發(fā)展完善,它將為體育的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究開創(chuàng)新局面。

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