氟環(huán)唑?qū)τ丑w絕對(duì)構(gòu)型的確定及殘留分析方法研究

張春艷 劉志偉 茍高章 楊倩文 施海燕 王鳴華

摘 要 采用Lux Cellulose-1手性柱，建立了氟環(huán)唑?qū)τ丑w的反相高效液相色譜拆分方法。采用高效液相CD檢測(cè)器確定了氟環(huán)唑?qū)τ丑w的旋光性和流出順序，通過比較實(shí)測(cè)圓二色光譜圖與計(jì)算圓二色光譜圖，確定了氟環(huán)唑?qū)τ丑w的絕對(duì)構(gòu)型。在此基礎(chǔ)上，建立了氟環(huán)唑?qū)τ丑w在蔬菜水果及土壤中的殘留分析方法，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了方法的精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度和基質(zhì)效應(yīng)。在優(yōu)化條件下，即以乙腈-水（60∶40，V/V）為流動(dòng)相、流速0.6 mL/min、柱溫30℃、檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，實(shí)現(xiàn)了氟環(huán)唑?qū)τ丑w的基線分離。手性柱上流出的第一個(gè)峰為（S，R）-（-）-氟環(huán)唑，第二個(gè)峰為（R，S）-（+）-氟環(huán)唑。在0.1～10.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，無明顯基質(zhì)效應(yīng)。氟環(huán)唑?qū)τ丑w在6種基質(zhì)中的平均回收率在80.8%～96.7%之間，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～6.1%， 日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～6.7%； 方法的最小檢出量（LOD）為0.10～0.15 ng，定量限（LOQ）為0.05 mg/kg。本方法能滿足食品和環(huán)境樣品中氟環(huán)唑?qū)τ丑w的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞 氟環(huán)唑； 對(duì)映體； 高效液相色譜； 絕對(duì)構(gòu)型； 殘留分析

1 引 言

隨著手性技術(shù)的不斷發(fā)展，手性農(nóng)藥已經(jīng)成為手性技術(shù)發(fā)展過程中的一大亮點(diǎn)，國(guó)際市場(chǎng)中商品化的農(nóng)藥中有30%是手性農(nóng)藥[1～4]。手性農(nóng)藥對(duì)映體通常具有相同的物理化學(xué)性質(zhì)，但當(dāng)手性農(nóng)藥作用于生物體時(shí)，其對(duì)映體的生物活性及生物體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)換、代謝以及毒性方面往往會(huì)存在較大差異[5～8]。如在三唑醇的4個(gè)對(duì)映體中，（1S，2R）的殺菌活性最高，而（1R，2S）和（1S，2S）的活性僅為（1S，2R）的1/70[9]。Huang等[10]研究了己唑醇的兩個(gè)對(duì)映體對(duì)水生生物斜生柵藻的急性毒性，結(jié)果表明（-）-對(duì)映體的毒性約為（+）-對(duì)映體的6倍。因此，從對(duì)映體水平研究手性農(nóng)藥的活性、毒性以及環(huán)境行為等，能更合理更準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。手性化合物絕對(duì)構(gòu)型的確定以及分析方法的建立是系統(tǒng)研究手性農(nóng)藥立體選擇性的基礎(chǔ)。確定絕對(duì)構(gòu)型的方法主要有X射線單晶衍射法、基于手性試劑和NMR的Mosher法結(jié)合、有機(jī)合成法及光譜法等[11～14]。由于電子圓二色（ECD）光譜法對(duì)分子基團(tuán)的空間取向非常敏感，能夠提供手性分子的三維結(jié)構(gòu)信息，目前已成為探索手性分子空間絕對(duì)構(gòu)型的有力工具。

氟環(huán)唑是一種內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，能抑制病菌麥角甾醇的合成，阻礙病菌細(xì)胞壁的形成。氟環(huán)唑具有殺菌廣譜、藥效高、低殘留、內(nèi)吸性強(qiáng)、持效期長(zhǎng)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于小麥、水稻、油菜、大豆、蘋果、葡萄、咖啡、煙草等作物的病害防治。氟環(huán)唑分子中含有兩個(gè)手性中心，存在4個(gè)對(duì)映體，但商品化的氟環(huán)唑是順式結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)對(duì)映體組成。目前有關(guān)氟環(huán)唑?qū)τ丑w的研究主要為手性拆分方法，殘留分析方法的報(bào)道較少。Han等[15]使用Chiralcel OJ-H手性柱，在正相、反相及極性有機(jī)相多種模式下對(duì)氟環(huán)唑進(jìn)行了拆分，并考察了不同流動(dòng)相比例對(duì)拆分的影響； Qiu等[16]在纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（Lux Cellulose-1）手性柱上用反相液相色譜基線分離了氟環(huán)唑； Tian等[17，18]建立了氟環(huán)唑在纖維素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（CDMPC）或直鏈淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯） （ADMPC）上的反相液相色譜拆分方法； 趙悅臣等[19]利用超高效合相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPC2-QTOF/MS），建立了順式-氟環(huán)唑在蘋果、葡萄和茶葉中的手性對(duì)映體拆分與殘留分析方法。而有關(guān)其對(duì)映體絕對(duì)構(gòu)型的研究尚無報(bào)道。

本研究采用反相高效液相色譜結(jié)合Lux Cellulose-1手性柱對(duì)氟環(huán)唑?qū)τ丑w進(jìn)行拆分，利用高效液相色譜CD檢測(cè)器確定其旋光性和對(duì)映體的流出順序，并通過比較實(shí)測(cè)和計(jì)算ECD光譜確定了氟環(huán)唑?qū)τ丑w的絕對(duì)構(gòu)型，在此基礎(chǔ)上，建立了氟環(huán)唑?qū)τ丑w在土壤、黃瓜、蘋果、梨、葡萄和番茄6種基質(zhì)中的殘留分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent-1200高效液相色譜儀（配VWD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）； CD-2095圓二色檢測(cè)器（日本Jasco公司）； J815圓二色光譜儀（日本Jasco公司）； R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）； CQ25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波江南儀器制造廠）； TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭儀器有限公司）； FA25勻漿機(jī)（德國(guó)Fluko公司）； MUL9000（A）-H-30型超純水系統(tǒng)（南京總馨純水設(shè)備有限公司）； Lux Cellulose-1手性色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）； Alumina-N、Cleanert Florisil、Cleanert-NH2 固相萃取柱（天津博納艾杰爾科技公司）。

氟環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品（98.5%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）； 氟環(huán)唑?qū)τ丑w標(biāo)準(zhǔn)品（98.0%，上海勤路生物技術(shù)有限公司）； 乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司）； 其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 流動(dòng)相比例的確定 測(cè)定氟環(huán)唑在220～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜，確定氟環(huán)唑的最大吸收波長(zhǎng)為220 nm。利用Lux Cellulose-1手性色譜柱，在柱溫30℃、流速0.6 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm的條件下，考察不同流動(dòng)相比例對(duì)氟環(huán)唑?qū)τ丑w拆分的影響。

2.2.2 氟環(huán)唑?qū)τ丑w流出順序與絕對(duì)構(gòu)型的確定 采用高效液相CD檢測(cè)器，在優(yōu)化的色譜條件下測(cè)定氟環(huán)唑外消旋體進(jìn)樣時(shí)兩個(gè)峰的旋光性和流出順序。

使用J815圓二色光譜儀，在室溫條件下以100 nm/min的速度在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)氟環(huán)唑?qū)τ丑w乙腈溶液掃描，重復(fù)3次，繪制出實(shí)測(cè)圓二色光譜圖（Electronic circular dichroism，ECD）。先將溶液中氟環(huán)唑?qū)τ丑w的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象進(jìn)行幾何優(yōu)化，選用密度泛函理論（Density functional theory， DFT）B3LYP方法進(jìn)行低能構(gòu)象的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。以對(duì)映體基態(tài)幾何結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，按電子吸收過程的垂直躍遷機(jī)制，利用含時(shí)密度泛函理論（Time-dependent DFT， TDDFT）中的Gaussian 09 計(jì)算方法[B3LYP/6-31+G*]，得到每個(gè)電子躍遷的激發(fā)態(tài)能量和轉(zhuǎn)動(dòng)速度，再根據(jù)擬合公式模擬得到計(jì)算ECD譜圖，溶劑模型為乙腈PCM模型[20，21]。通過比較計(jì)算圓二色光譜和實(shí)測(cè)圓二色光譜確定氟環(huán)唑?qū)τ丑w的絕對(duì)構(gòu)型。

2.2.3 樣品提取方法 （1）黃瓜、番茄、葡萄、蘋果：分別稱取20 g均質(zhì)樣品于100 mL離心管中，加入40 mL乙腈，勻漿5 min，超聲20 min，4000 r/min離心5 min，取20 mL上清液，過無水Na2SO4，濃縮近干，待凈化。 （2）梨：稱取20 g均質(zhì)樣品于三角瓶中，加入60 mL二氯甲烷，振蕩1 h，抽濾，過無水Na2SO4，濃縮近干，待凈化。（3）土壤：稱取10 g土壤樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水和30 mL乙腈，渦旋10 min，超聲20 min，再加入3 g NaCl，渦旋1 min，4000 r/min離心5 min，取15 mL過無水Na2SO4，濃縮近干，待凈化。

2.2.4 凈化方法 Alumina-N SPE小柱先用6 mL正己烷預(yù)淋，再用8 mL正己烷分兩次溶解上樣，用10 mL正己烷：丙酮（95∶5， V/V）淋洗小柱，抽干小柱，10 mL二氯甲烷-正己烷（60∶40，V/V）洗脫，收集洗脫液，45℃濃縮至干，1 mL乙腈定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 準(zhǔn)確稱取氟環(huán)唑外消旋體標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0102 g，用乙腈配制成1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)母液，再梯度稀釋成0.1～10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。根據(jù)2.2.3節(jié)和2.2.4節(jié)的提取和凈化方法制備空白基質(zhì)樣品，分別使用0.1～10.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別建立溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和各基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率評(píng)價(jià)方法的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3.2 準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度 在空白樣品中添加3檔濃度的氟環(huán)唑?qū)τ丑w標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為0.05、0.5和1.0 mg/kg，每個(gè)添加濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，避光條件下放置8 h，按2.2節(jié)的方法提取凈化，計(jì)算回收率，評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確度和精密度，并分別考察方法的日間精密度和日內(nèi)精密度。

2.4 對(duì)映體分離效果評(píng)價(jià)方法

手性化合物拆分中常用保留因子（Capacity factor， k′）、分離因子（Separation factor， ɑ）和分離度（Resolution， Rs）評(píng)價(jià)分離效果，計(jì)算公式如下：

式中，t0為系統(tǒng)死時(shí)間，由溶劑峰測(cè)定，測(cè)定的溶液一般是磷酸二氫鉀的鹽溶液，t為對(duì)映體色譜峰的保留時(shí)間，t1和t2為分別為兩個(gè)對(duì)映體的色譜峰保留時(shí)間，w1和w2為對(duì)映體峰寬。分離度Rs≥1.5時(shí)，兩個(gè)相鄰峰達(dá)到基線分離，標(biāo)志著兩個(gè)峰已完全分離； 當(dāng)Rs<1時(shí)，兩個(gè)峰之間有互相重疊的部分。

3 結(jié)果與討論

3.1 分離條件的優(yōu)化

考察了不同比例的乙腈-水對(duì)氟環(huán)唑?qū)τ丑w拆分的影響，分離結(jié)果如表1所示，在流速為0.6 mL/min，流動(dòng)相為55%～85%乙腈的條件下，隨著乙腈含量增加，保留時(shí)間逐漸縮短，t1從17.61 min減小到7.23 min， t2從30.13 min減小到9.88 min。在所有條件下，氟環(huán)唑?qū)τ丑w均能較好地實(shí)現(xiàn)分離，分離度在7.83～12.03之間。但在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，氟環(huán)唑?qū)τ丑w在乙腈-水（60∶40，V/V）中未受到雜質(zhì)干擾，而在乙腈-水（70∶30，80∶20，V/V）等比例條件下，目標(biāo)化合物均會(huì)受到樣品雜質(zhì)的干擾。 因此， 選擇乙腈-水（60∶40，V/V）作為最佳流動(dòng)相。此外，隨著流速增加，氟環(huán)唑?qū)τ丑w分離度變化不大，但對(duì)映體的響應(yīng)值逐漸減小，故選擇流速為0.6 mL/min。

3.2 氟環(huán)唑?qū)τ丑w流出順序和絕對(duì)構(gòu)型的確定

采用高效液相CD檢測(cè)器，在優(yōu)化色譜條件下測(cè)定氟環(huán)唑外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品的出峰順序（圖1）。結(jié)果表明，Lux Cellulose-1手性色譜柱上第一個(gè)被洗脫出的對(duì)映體為（-）-氟環(huán)唑，第二個(gè)峰為（+）-氟環(huán)唑，此流出順序與Zhang等[22]報(bào)道的結(jié)果一致。通過比較計(jì)算和實(shí)測(cè)ECD光譜圖（圖2），發(fā)現(xiàn)二者的變化趨勢(shì)一致。由此可知，圖1中第一個(gè)峰為（S，R）-（-）-氟環(huán)唑，第二個(gè)峰為（R，S）-（+）-氟環(huán)唑。

3.3 前處理方法的優(yōu)化

考察了乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷3種對(duì)氟環(huán)唑溶解度較高的有機(jī)溶劑對(duì)不同基質(zhì)中氟環(huán)唑提取效率的影響。結(jié)果表明，乙腈為提取溶劑時(shí)，土壤、黃瓜、番茄、葡萄、蘋果中氟環(huán)唑?qū)τ丑w的平均回收率在84.1%～91.2%之間，梨中的平均回收率低于73.8%； 二氯甲烷作為萃取劑時(shí)，梨中的添加回收率達(dá)到90.8%以上，而使用乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，各種基質(zhì)中氟環(huán)唑的回收率均偏低（64.2%～71.2%）。故針對(duì)不同基質(zhì)，選擇最適的提取溶劑，以取得較高的回收率，即土壤、黃瓜、番茄、葡萄、蘋果選用乙腈作為提取溶劑，梨選用二氯甲烷作為提取溶劑。

蔬菜水果中一般含有大量色素、甾醇及糖類等雜質(zhì)，會(huì)干擾目標(biāo)化合物的檢測(cè)。固相萃取是凈化雜質(zhì)常用方法之一， 本研究比較了Alumina-N、Cleanert Florisil和Cleanert-NH2 3種固相萃取柱（SPE）凈化效果。Cleanert-NH2 SPE小柱先用6 ml正己烷預(yù)淋，再用8 mL正己烷分兩次溶解上樣，用8 mL正己烷-丙酮（95∶5，V/V）淋洗小柱，10 mL正己烷-丙酮（90∶10，V/V）洗脫小柱； Cleanert Florisil SPE小柱先用6 ml正己烷預(yù)淋，再用8 mL正己烷分兩次溶解上樣，用8 mL正己烷淋洗小柱，10 mL正己烷-丙酮（90∶10，V/V）洗脫小柱； Alumina-N的凈化條件見2.2.4節(jié)。結(jié)果表明，Cleanert-NH2 SPE回收率較低（<60%）； Alumina-N SPE和Cleanert Florisil SPE均能達(dá)到回收率要求，而Alumina-N SPE的凈化效果優(yōu)于Cleanert Florisil SPE。因此，選取Alumina-N SPE作為氟環(huán)唑在各基質(zhì)中的凈化小柱。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)

氟環(huán)唑?qū)τ丑w在溶劑和各基質(zhì)中的回歸方程和基質(zhì)效應(yīng)見表2。在0.1～10.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，R2>0.9998。分析結(jié)果表明，基質(zhì)斜率與溶劑斜率之比在0.99～1.01之間，說明氟環(huán)唑在各基質(zhì)中沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，可采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測(cè)。 （S，R）-（-）-氟環(huán)唑的線性回歸方程為y=78.829x-1.2522（R2=0.9998）； （R，S）-（+）-氟環(huán)唑的線性回歸方程為y = 79.12x-1.4583（R2=0.9999）。二者的線性范圍均為0.1～10.0 mg/L， 圖3添加0.05 mg/kg氟環(huán)唑外消旋體的土壤樣品典型色譜圖。

3.5 準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

氟環(huán)唑在6種基質(zhì)中的添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，（S，R）-（-）-氟環(huán)唑在各基質(zhì)中的平均回收率在80.8%～96.7%之間，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.5%～6.1%，日內(nèi)RSD為11%～62%； （R，S）-（+）-氟環(huán)唑在各基質(zhì)中的平均回收率在824%～935%之間，日間RSD為27%～59%，日內(nèi)RSD為22%～67%。方法的定量限（LOQ）為0.05 mg/kg，最小檢出量（LOD）為0.10～0.15 ng。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2763-2016），氟環(huán)唑在蘋果和葡萄中的最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）為0.5 mg/kg，本方法的LOQ為MRL值的1/10，且方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則（NY/T 788-2004）的相關(guān)要求，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。與文獻(xiàn)[22]（LOD≤1.4 μg/kg，LOQ≤4.7 μg/kg）相比，本方法靈敏度較低，但能滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求，可為氟環(huán)唑?qū)τ丑w選擇性研究提供參考。

4 結(jié) 論

利用HPLC結(jié)合Lux Cellulose-1手性色譜柱對(duì)氟環(huán)唑?qū)τ丑w進(jìn)行了拆分，確定了最佳拆分條件。通過高效液相CD檢測(cè)器確定了氟環(huán)唑?qū)τ丑w的流出順序，通過比較實(shí)測(cè)與計(jì)算ECD結(jié)果確定了氟環(huán)唑?qū)τ丑w的絕對(duì)構(gòu)型。從手性柱上第一個(gè)被洗脫出來的峰為（S，R）-（-）-氟環(huán)唑，第二個(gè)被洗脫出來的峰為（R，S）-（+）-氟環(huán)唑。與傳統(tǒng)的構(gòu)型確定方法相比，計(jì)算化學(xué)確定手性化合物的絕對(duì)構(gòu)型更加方便快捷，且具有很高的可信度和準(zhǔn)確性[23]。在此基礎(chǔ)上，建立了氟環(huán)唑?qū)τ丑w在蔬菜水果及土壤中的殘留分析方法，氟環(huán)唑?qū)τ丑w在0.1～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，本方法無基質(zhì)效應(yīng)。方法的平均回收率為80.8%～96.7%，日間RSD在1.5%～6.1%之間，日內(nèi)RSD在1.1%～6.7%之間； 定量限（LOQ）為0.05 mg/kg。本研究為食品和環(huán)境中氟環(huán)唑?qū)τ丑w的定量測(cè)定提供了一種快速、準(zhǔn)確的方法，為系統(tǒng)評(píng)價(jià)手性殺菌劑氟環(huán)唑的立體選擇性和安全性提供了參考。

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