細(xì)胞膜色譜研究進(jìn)展及其在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用

王曉宇 陳嘯飛 顧妍秋 曹巖 原永芳 洪戰(zhàn)英 柴逸峰

摘 要 細(xì)胞膜色譜法作為近年來發(fā)展迅速的生物色譜技術(shù)，已成為篩選中藥復(fù)雜體系中活性成分和研究藥物與受體相互作用的重要工具。本文綜述了細(xì)胞膜色譜技術(shù)的發(fā)展、分離原理、制備方法、針對其穩(wěn)定性和壽命等問題進(jìn)行的制備方法學(xué)優(yōu)化、多種二維色譜方法學(xué)和應(yīng)用策略，以及在中藥等復(fù)雜體系活性成分篩選中的應(yīng)用情況。在此基礎(chǔ)上， 本文展望了細(xì)胞膜色譜技術(shù)未來的發(fā)展趨勢，以期為細(xì)胞膜色譜技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展以及在藥物高通量篩選領(lǐng)域的拓展應(yīng)用提供思路。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞膜色譜法； 共價(jià)制備策略； 全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)； 中藥活性成分篩選； 評述

1 引 言

細(xì)胞膜色譜（Cell membrane chromatography， CMC）是近年發(fā)展迅速的一種生物親和色譜技術(shù)，以細(xì)胞膜與色譜載體作為固定相，采用色譜分析法，可在體外模擬藥物分子與細(xì)胞膜受體的相互作用過程。細(xì)胞膜色譜法將復(fù)雜成分分離與化合物活性篩選結(jié)合，具有操作方便、快速穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于中藥等復(fù)雜體系的活性成分篩選。該技術(shù)自發(fā)明以來，經(jīng)過方法學(xué)的不斷改進(jìn)與完善，發(fā)展了近30種細(xì)胞膜色譜模型，成功應(yīng)用于40余種中藥或復(fù)方的活性成分篩選，同時(shí)應(yīng)用于研究藥物-受體相互作用[1]。本文對細(xì)胞膜色譜技術(shù)的研究進(jìn)展及其在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)綜述。

2 細(xì)胞膜色譜法的原理

細(xì)胞膜色譜法由西安交通大學(xué)賀浪沖教授課題組于1996年首次報(bào)道[2]，是一種以具有活性的細(xì)胞膜受體為固定相的仿生親合色譜技術(shù)，此技術(shù)利用細(xì)胞膜自身的融合作用和硅膠表面硅羥基（Si-OH）的吸附作用制備成細(xì)胞膜色譜固定相（Cell membrane stationary phase， CMSP），最大限度地保持了細(xì)胞膜的完整性、膜受體的空間結(jié)構(gòu)以及生物活性[3]。細(xì)胞膜色譜固定相示意圖如圖1A所示，中心紅色球體代表硅膠，周圍橙色代表細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，藍(lán)色代表細(xì)胞膜上的蛋白或受體，細(xì)胞膜和硅膠載體之間以氫鍵吸附作用結(jié)合，鍵合細(xì)胞膜后的硅膠載體掃描電鏡圖像如圖1B[3]所示。以 K+， Na+-三磷酸腺苷（K+， Na+-ATP）酶作為活性指標(biāo)，測定結(jié)合硅膠后的細(xì)胞膜、混懸液狀細(xì)胞膜和沉淀狀細(xì)胞膜，這三者之間酶活性無差異，可見硅膠可作為細(xì)胞膜的理想載體[4]； 細(xì)胞膜色譜固定相具有色譜分離和活性表征的雙重功能，廣泛應(yīng)用于復(fù)雜體系藥物活性成分的篩選分析以及藥物與膜受體相互作用分析。

3 細(xì)胞膜色譜法方法學(xué)研究進(jìn)展

細(xì)胞膜色譜技術(shù)自建立以來得到了廣泛應(yīng)用，但仍然存在一些問題有待解決。首先，柱壽命短，其主要原因在于附著在硅膠上的細(xì)胞膜蛋白容易脫落或失去活性，影響了篩選結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。其次，對細(xì)胞膜色譜柱的制備質(zhì)量缺乏一個(gè)較為統(tǒng)一的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，這使得不同細(xì)胞膜色譜柱之間質(zhì)量差異較大，難以獲得理想的重現(xiàn)性。此外，細(xì)胞膜色譜作為一種生物色譜，其本身的柱效和理論塔板數(shù)都較低，因此，細(xì)胞膜色譜與二維色譜串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)合使用大大提升了其作為篩選工具的適用性和通量。

3.1 細(xì)胞膜色譜柱制備條件優(yōu)化

本課題組Ding等[5]對細(xì)胞膜色譜柱的制備過程中3個(gè)關(guān)鍵步驟（細(xì)胞用量、細(xì)胞破碎和裝柱流程）進(jìn)行了方法學(xué)考察和優(yōu)化，使細(xì)胞膜色譜柱壓更穩(wěn)定、柱效更高，并對細(xì)胞膜色譜模型的制備過程進(jìn)行了全面考察，建立起了一系列質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，為實(shí)驗(yàn)室制定了該項(xiàng)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，有效提高了細(xì)胞膜色譜模型制備的重現(xiàn)性。

細(xì)胞膜色譜柱在使用過程中，細(xì)胞膜表面的受體蛋白在使用過程中可能會發(fā)生失活，逐漸失去其原有的生物活性； 另一方面，固定相表面結(jié)合的細(xì)胞膜容易在流動(dòng)相的沖洗下脫落，以上兩個(gè)原因?qū)е录?xì)胞膜色譜柱的柱壽命較短，一般連續(xù)使用48～72 h后即失效。Ding等[5] 采用多聚甲醛處理鍵合了細(xì)胞膜的固定相，多聚甲醛可以與蛋白表面氨基交聯(lián)，同時(shí)使膜蛋白容易保持其空間構(gòu)型，經(jīng)此處理后細(xì)胞膜與硅膠的結(jié)合穩(wěn)定性得到顯著提高。然而，多聚甲醛作為一種蛋白交聯(lián)劑，可能會導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)破壞，活性下降，不能保證篩選結(jié)果的可靠性。因此，需要建立一種在不損傷細(xì)胞膜的同時(shí)，又能提高細(xì)胞膜在硅膠載體上的附著力的新方法。

Ding等[6]制備了一種3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane， APTES）修飾的硅膠，并應(yīng)用于細(xì)胞膜色譜的制備過程中，改變傳統(tǒng)的細(xì)胞膜和硅膠載體之間主要靠氫鍵和范德華力的非共價(jià)結(jié)合模式，實(shí)現(xiàn)了硅膠載體和細(xì)胞膜之間以共價(jià)鍵結(jié)合。如圖2所示，其原理是以APTES為橋梁，連接一個(gè)戊二醛增加連接臂長度，在硅膠表面鍵合了醛基基團(tuán)，而細(xì)胞膜是由豐富的磷脂組成的，含有大量氨基基團(tuán)，因此鍵合在硅膠表面的醛基與細(xì)胞膜上氨基在室溫環(huán)境中易發(fā)生醛氨縮合反應(yīng)，以共價(jià)鍵的形式結(jié)合，這大大提高了細(xì)胞膜在硅膠表面的附著力，同時(shí)又避免了對膜蛋白結(jié)構(gòu)的破壞。該方法提高了細(xì)胞膜在硅膠載體表面的穩(wěn)定性，降低了細(xì)胞膜脫落概率，有效延長了細(xì)胞膜色譜柱的使用壽命，從原有的不足3天延長到12天以上，此外，在柱活性下降最快的前3天，陽性藥吉非替尼的保留時(shí)間RSD也由20%下降到低于10%，重現(xiàn)性顯著提高。采用該方法制備的細(xì)胞膜色譜柱可用于一些難以培養(yǎng)、較難獲得的珍稀細(xì)胞，建立的模型可延長細(xì)胞膜生物活性，顯著提升了穩(wěn)定性，提高了細(xì)胞膜色譜柱適應(yīng)性。

3.2 細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)優(yōu)化

隨著分析儀器和分析方法的發(fā)展和進(jìn)步，細(xì)胞色譜分析系統(tǒng)也得到了不斷的更新和提升，從最開始的單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)到“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，以及近年發(fā)展的全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)。單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)無法對篩選得到的結(jié)果直接進(jìn)行分離和鑒定，在后續(xù)的分析過程中可能會丟失一些信息。而“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)具有自己的分析鑒定系統(tǒng)，彌補(bǔ)了單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)的不足，同時(shí)由離線發(fā)展到在線，減少了分析步驟，縮短了分析時(shí)間。而全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)在線、全自動(dòng)的分析過程，并可對細(xì)胞膜色譜柱中所有的組分進(jìn)行分離分析。

3.2.1 單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng) 單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，可以用細(xì)胞膜色譜柱作為分離分析系統(tǒng)，根據(jù)化合物在細(xì)胞膜色譜圖上的保留行為，篩選出潛在活性成分。單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)如圖3所示，將復(fù)雜體系的樣品進(jìn)樣到細(xì)胞膜色譜中，根據(jù)細(xì)胞膜色譜的分離分析功能將樣品進(jìn)行分離，在由檢測器給出保留行為圖譜。趙小娟等[7]制備了犬血管細(xì)胞膜色譜，對淫羊藿根與葉的活性成分進(jìn)行了分析比較，結(jié)果表明，淫羊藿根乙醚提取物在細(xì)胞膜色譜上有保留行為。進(jìn)一步將淫羊藿根乙醚提取液用高效液相色譜分離得到17個(gè)樣品，再用細(xì)胞膜色譜對該17個(gè)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有2個(gè)成分（YYH-214，YYH-216）和陽性藥維拉帕米一樣能在細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)上產(chǎn)生保留行為。張漢利等[8]應(yīng)用大鼠血管和心肌細(xì)胞膜色譜篩選出太白花中含有對主動(dòng)脈血管有舒張作用、對心肌收縮有抑制作用的有效成分。高琨等[9]采用大鼠血管細(xì)胞膜色譜篩選出紅毛七中對主動(dòng)脈血管有舒張作用的有效成分。該方法的不足之處在于無法對篩選得到的有效成分進(jìn)行直接分離和鑒定，需借助另一種分析系統(tǒng)進(jìn)一步對有效部位進(jìn)行分離分析，步驟繁瑣耗時(shí)，第一維色譜的信息有所丟失。

3.3.2 “中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng) 鑒于細(xì)胞膜色譜本身分離效能的局限性和檢測系統(tǒng)單一性的問題，單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)無法同時(shí)做到對有效活性組分的高效分離、快速識別和準(zhǔn)確鑒定，因此需借助快速的分離系統(tǒng)和高靈敏的檢測系統(tǒng)對活性組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離鑒定。為了實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析篩選活性成分，研究者發(fā)展了一種離線“中心切割”二維色譜離線分析方法，該方法的原理是將第一維的組分通過檢測器識別后，將潛在的活性組分分別收集，離線導(dǎo)入第二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）或氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）進(jìn)行離線分析。如文獻(xiàn)[10，11]采用血管內(nèi)皮細(xì)胞膜色譜-GC-MS方法篩選白芷、羌活、北沙參、蛇床子和五味子，發(fā)現(xiàn)歐前胡素、蛇床子素和五味子甲素對血管平滑肌細(xì)胞有舒張作用。文獻(xiàn)[12，13]采用腹腔巨噬細(xì)胞膜色譜-GC-MS方法篩選白術(shù)和羅田蒼術(shù)，發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯I對腹腔巨噬細(xì)胞有抗炎作用。然而，這種離線二維方法需要對色譜流份進(jìn)行收集和富集，步驟較為繁瑣，耗時(shí)較長。研究者又發(fā)展了一種“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜在線分析系統(tǒng)，樣品通過細(xì)胞膜色譜柱分離后可直接進(jìn)入MS系統(tǒng)進(jìn)行識別和鑒定，大大減少了工作量，縮短了分析時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)在線監(jiān)測分析，如CMC-online-HPLC/MS[14]。Li等[15]建立HEK293/VEGFR-CMC-online-HPLC/MS方法篩選烏頭中作用于VEGFR-2受體的抗癌活性成分有中烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿。Sun等[16]建立A431/CMC-online-HPLC/MS方法篩選紅毛七總生物堿中作用于人EGFR受體活性成分有塔斯品堿和紅毛新堿。Wang等[17]建立α1AAR-CMC-online-HPLC/MS方法篩選紅毛七中作用于人α1A-腎上腺素受體的活性成分有木蘭花堿和紅毛新堿。Wang等[18]建立A431/CMC-online-HPLC/MS方法篩選苦參中EGFR受體拮抗劑有氧化苦參堿和苦參堿。Ren等[19]建立Prostate/CMC-online-HPLC/MS方法篩選蓮子心中作用于α1A-AR受體的具有抗前列腺癌作用的活性成分有蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿。研究表明，在線二維細(xì)胞膜色譜技術(shù)為中藥復(fù)雜體系中活性成分的快速篩選、同分異構(gòu)體的表征、動(dòng)物攝取中藥后體內(nèi)代謝產(chǎn)物的檢測提供了一種高效、快速、適用性強(qiáng)的方法體系[20]。

3.3.3 全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng) 目前，“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜模式仍存在下列問題：（1）第一維紫外檢測器的識別可能忽略一系列低紫外吸收的活性成分； （2）第二維使用常規(guī)的HPLC或GC-MS需要較長的分離分析時(shí)間； （3）常規(guī)質(zhì)譜定性能力弱，一般需要對照品來鑒別非靶標(biāo)組分，而中藥復(fù)雜成分標(biāo)準(zhǔn)品較難獲得，從而影響了細(xì)胞膜色譜分析的通量和準(zhǔn)確度。為解決上述問題，本課題組發(fā)展了一種新的全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)。Chen等[21]首次建立全二維HepG2肝癌/CMC/整體柱/TOFMS分析系統(tǒng)，并應(yīng)用于篩選黃柏和苦參中抗肝癌活性成分，該系統(tǒng)組成如圖4所示。全二維系統(tǒng)的第一維色譜是細(xì)胞膜色譜柱，由一個(gè)單元泵輸送流動(dòng)相10 mmol/L醋酸銨溶液，第二維色譜是反相色譜柱，由一個(gè)二元泵負(fù)責(zé)輸送流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)梯度洗脫。為實(shí)現(xiàn)第一維與第二維色譜同步分析，用一個(gè)十通閥將這兩維色譜橋連起來，并設(shè)置為每隔 2.5 min進(jìn)行自動(dòng)切換。在A和B 狀態(tài)的不斷切換過程中，第一維細(xì)胞膜色譜柱的全部組分都能夠進(jìn)入到第二維色譜分離柱中進(jìn)行分離，并串聯(lián)高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF/MS）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。在此全二維系統(tǒng)中，第一維組分可以全部流入第二維色譜柱中進(jìn)行進(jìn)一步的分離分析，因此，無需對第一維的組分進(jìn)行鑒定和表征，可利用第二維分離柱-TOF/MS強(qiáng)大的分離和鑒定能力，結(jié)合MATLAB工作站的數(shù)據(jù)處理和繪圖功能對有親和活性的組分進(jìn)行快速表征和鑒別，成功彌補(bǔ)“中心切割”二維色譜的一些缺陷和不足。在此基礎(chǔ)上，Chen等[22]建立正常/阿霉素誘導(dǎo)心衰比較全二維CMC/整體柱/TOF-MS方法篩選附子中抗阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭的活性成分，通過構(gòu)建正常大鼠的心肌組織細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)和衰竭大鼠的心肌組織細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)，比較附子提取液在兩者之間保留行為差異，從附子中成功篩選出16種心肌細(xì)胞膜結(jié)合成分和3種專屬性的抗心衰活性成分，比較全二維色譜圖譜如圖5所示。Wu等[23]建立全二維K562/CMC/C18柱/TOF-MS系統(tǒng)篩選青黛中抗白血病活性成分。Wang等[24]建立SMMC-7721/CMC和HepG2/CMC18柱/TOF-MS系統(tǒng)，成功地對一系列人工合成的VEGFR抑制劑的活性進(jìn)行排序。考慮到在生物體內(nèi)的靶組織上實(shí)際起作用的活性成分不一定是小分子，也有可能是其代謝產(chǎn)物，全二維細(xì)胞膜色譜不僅可應(yīng)用于篩選中藥提取液中潛在活性成分，也適用于中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物的篩選。Jia等[25]建立了全二維HepG2 肝癌/CMC/C18柱/TOF-MS 分析系統(tǒng)，篩選口服黃芩提取液后的大鼠血清中抗肝癌活性成分。全二維分析系統(tǒng)通量高，準(zhǔn)確性、專屬性、適用性良好，極大提高了細(xì)胞膜色譜技術(shù)的分辨能力，且TOF-MS可提供每一個(gè)活性組分的精確質(zhì)量信息和豐富的離子碎片信息，在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的條件下也可以獲得可信的化合物鑒別分析結(jié)果，因此十分適用于中藥等天然藥物的復(fù)雜體系中有效的活性成分的篩選。

4 細(xì)胞膜色譜技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用

中藥及天然藥物中成分繁多且復(fù)雜，如何快速鑒定其中的活性組分一直是中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的難題。隨著細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)的快速發(fā)展，細(xì)胞膜色譜法從中藥及天然藥物中篩選有效活性成分的應(yīng)用越來越廣泛。此外，二維細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)具有方法快速、操作簡捷、穩(wěn)定可靠等特點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系活性成分的篩選[26]。表1中列出了近年細(xì)胞膜色譜用于中藥活性成分篩選的應(yīng)用研究的統(tǒng)計(jì)和概述。

5 總結(jié)和展望

細(xì)胞膜色譜技術(shù)經(jīng)歷了二十余年的發(fā)展，多個(gè)課題組對細(xì)胞膜色譜制備方法學(xué)進(jìn)行了全面的考察和研究，其制備過程得到不斷的完善和優(yōu)化。重要的是，細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)從最開始的單維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，發(fā)展到“中心切割”二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，再到全二維細(xì)胞膜色譜分析系統(tǒng)，從離線發(fā)展到在線，不斷減少分析步驟、縮短分析時(shí)間，提高了準(zhǔn)確性和通量。大量研究表明，新型細(xì)胞膜色譜制備技術(shù)結(jié)合全二維色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜技術(shù)非常適用于復(fù)雜體系中活性成分的篩選。然而，在細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)中，為了保證分析的有效性，通常需要大量細(xì)胞（約3 × 107個(gè)）進(jìn)行色譜柱的制備，無法適用于原代細(xì)胞等難以獲得或擴(kuò)增的珍稀細(xì)胞系。Tang等[52]嘗試將細(xì)胞膜色譜搭載于在石英毛細(xì)管上，建立了毛細(xì)管細(xì)胞膜色譜，并應(yīng)用于篩選天然產(chǎn)物中活性成分； Zhang等[53]首次建立了開放管狀毛細(xì)管細(xì)胞膜色譜，具有與普通CMC相似的色譜保留因子和穩(wěn)定性，但細(xì)胞膜消耗量比CMC低數(shù)百倍。然而，這類開管的毛細(xì)管細(xì)胞膜色譜存在均一性低、無法與二維色譜、質(zhì)譜在線串聯(lián)等問題。因此，建立基于微型/nano色譜柱的細(xì)胞膜色譜多維分析系統(tǒng)是細(xì)胞膜色譜方法學(xué)發(fā)展的趨勢。同時(shí)，微型/nano色譜具有靈敏度高、細(xì)胞用量少、可陣列化等優(yōu)點(diǎn)，使得細(xì)胞膜色譜在高通量藥物-受體相互作用表征和化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。細(xì)胞膜色譜技術(shù)作為一種兼有色譜分離和活性篩選雙重特性的藥物活性分析方法，未來將向集成化、微型化、陣列化和自動(dòng)化的方向快速發(fā)展。

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