燒傷后增生性瘢痕組織中顆粒蛋白前體、環(huán)氧合酶2的表達水平及其與炎性因子的相關性▲

黃 云 許喜生 陳 凱 李 佳

(郴州市第一人民醫(yī)院燒傷整形外科，湖南省郴州市 423000)

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是燒傷傷口愈合的常見并發(fā)癥，隨著時間的推移，HS可導致患者身體活動受限(如攣縮、緊繃、僵硬等)、神經性癥狀(如疼痛、瘙癢等)，甚至產生焦慮，嚴重影響燒傷幸存患者的身心健康和生活質量[1]。近年來，HS的治療方法已有較大進展，然而HS一旦發(fā)生，很難通過非手術方式徹底清除[2]。因此，了解HS的發(fā)病機制，做到早期防治至關重要。顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種多功能分泌蛋白，在細胞增殖、腫瘤發(fā)生及炎癥反應調節(jié)中起重要作用，還廣泛參與神經系統(tǒng)和其他系統(tǒng)的各種疾病，如胃炎、敗血癥、結腸癌等[3]。研究表明，PGRN對機體損傷后的修復過程具有重要的調控作用[4]。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)也被稱為前列腺素內氧化酶還原酶，目前發(fā)現COX包含2種異構體，分別為COX-1和COX-2，其中誘導型COX-2作為炎性反應的介質，參與多種病理生理過程，其表達水平在炎癥刺激下呈增高趨勢[5]。此外，瘢痕組織中COX的表達水平增高，使用相關藥物阻斷COX的表達可能是治療病理性瘢痕的輔助手段[5]。因此，本研究檢測PGRN和COX-2在燒傷后HS組織中的表達水平，分析其與炎性因子的相關性，初步探討PGRN和COX-2在燒傷后HS中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年9月至2019年9月在我院燒傷整形外科診治的54例燒傷后HS患者，其中男性30例、女性24例，年齡18～48(28.59±7.8)歲；肩背部和四肢燒傷32例、面頸部燒傷22例。納入標準：(1)經臨床和病理學檢查確診為燒傷后HS；(2)瘢痕切除術前未接受其他瘢痕治療；(3)無家族性瘢痕增生史及金屬元素接觸史；(4)病理檢查提示無惡變。排除標準：(1)合并血液系統(tǒng)疾病者；(2)依從性差者；(3)合并瘢痕疙瘩者；(4)合并皮膚疾病者；(5)妊娠或哺乳期婦女；(6)合并惡性腫瘤者；(7)瘢痕組織局部感染者。本研究經過我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均對本研究知情同意。

1.2 主要試劑與儀器 PGRN多克隆抗體(上海烜雅生物科技有限公司，貨號：XY-KT-1824)，COX-2多克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，貨號：PAB24809)，山羊抗兔IgG(H+L)二抗工作液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：A0277)，辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液、DAB試劑(北京索萊寶科技有限公司，貨號：SE068、DA1010)，蘇木素染色液(百濟神州生物藥業(yè)有限公司，貨號：C8470)，TRIzol試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,貨號：10296028)，反轉錄試劑盒和AceQ qPCR SYBR? Green Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號：R133-01、Q511-02/03)。微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，型號：NanoDrop 2000c)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司，型號：HH-B11)，立式冷藏柜(青島海爾股份有限公司，型號：BCD-227B型)，微型超速冷凍離心機(Beckman Coulter公司，型號：BEA21)，石蠟切片機(江蘇世泰實驗器材有限公司，型號：RM2245)，光學顯微鏡(日本Olympus公司，型號：CX23)，實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，型號：CFX384)。

1.3 方法

1.3.1 標本獲?。涸隈：矍谐g過程中收集患者的HS組織樣本0.5 g，同時留取患者植皮取皮時多余的正常皮膚組織標本0.5 g。將新鮮采集的一部分標本固定在10%的中性甲醛中，使用乙醇進行常規(guī)脫水，浸泡在二甲苯中，然后石蠟包埋，做成4 μm厚的切片待用。將其余部分標本置于-80 ℃液氮中保存待用。

1.3.2 免疫組織化學染色：將1.3.1中的切片進行常規(guī)脫蠟；在0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)中煮沸(95 ℃)18 min進行抗原修復；在切片上滴加3% H2O2室溫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶的活性，采用PBS沖洗切片3次，每次3 min；滴加正常兔血清孵育20 min，甩去多余液體；滴加250 μL PGRN(稀釋比1∶200)和250 μL COX-2多克隆抗體(稀釋比1∶150)，置于4 ℃冰箱孵育過夜，使用PBS沖洗切片3次，每次5 min；滴加100 μL山羊抗兔IgG二抗工作液(稀釋比1∶1 000)，37 ℃孵育40 min，使用PBS沖洗切片3次，每次5 min；滴加50 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，使用PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色，水洗后使用蘇木素進行復染；梯度乙醇脫水、透明、干燥，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。隨機觀察5個視野，計數100個細胞確定陽性細胞的百分比，陽性細胞的判定：PGRN主要定位于細胞質內，呈棕黃色顆粒狀；COX-2主要定位于細胞漿中，呈棕黃色顆粒、彌漫分布。結果判讀：陰性指陽性細胞百分比<6%；弱陽性指陽性細胞百分比為6%～<26%；陽性指陽性細胞百分比為26%～49%；強陽性指陽性細胞百分比>49%。其中弱陽性、陽性、強陽性均定義為陽性表達[6]。

1.3.3 實時熒光定量PCR：參照TRIzol試劑盒說明書步驟提取各組織的總RNA，然后參照反轉錄試劑盒說明書的操作步驟將RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用AceQ qPCR SYBR? Green Mix進行實時熒光定量PCR。反應體系包括AceQ qPCR SYBR? Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，ddH2O加至10 μL。反應條件：預變性95 ℃，90 s；變性95 ℃，30 s，退火63 ℃，30 s，延伸72 ℃，15 s，共40個循環(huán)。以β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算PGRN、COX-2、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-1β及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA相對表達水平。每組實驗重復3次。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用(x±s)表示，組間比較采用配對t檢驗；計數資料采用例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2蛋白陽性表達率的比較 HS組織中的PGRN和COX-2蛋白陽性表達率均高于正常皮膚組織(均P<0.05)，見表2。

表2 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2蛋白陽性表達率的比較[n(%)]

2.2 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2及炎性因子mRNA表達水平的比較 HS組織中PGRN、COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA表達水平均高于正常皮膚組織，IL-10 mRNA表達水平低于正常皮膚組織(均P<0.05)，見表3。

表3 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2及炎性因子的mRNA相對表達水平比較(x±s)

2.3 HS組織中PGRN、COX-2、炎性因子的mRNA表達水平的相關性 Pearson相關性分析結果顯示，HS組織中PGRN mRNA表達水平與COX-2 mRNA表達水平呈正相關(r=0.489，P=0.003)；HS組織中PGRN和COX-2的mRNA表達水平與IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平均呈正相關，與IL-10的mRNA表達水平均呈負相關(均P<0.05)。見圖1、表4。

表4 HS組織中PGRN、COX-2的mRNA表達水平與炎性因子mRNA表達水平的相關性

3 討 論

HS是燒傷傷口愈合最常見的后遺癥，研究表明，在燒傷傷口愈合1年內31%～90%的患者會出現HS[7]。盡管藥物療法和手術切除能夠治療HS，但復發(fā)率仍較高[8]。深入了解HS潛在的形成機制，有助于發(fā)現預防和治療HS的新靶點。

研究表明，慢性炎癥反應與瘢痕形成有關[9]。PGRN是一種多功能生長因子，能夠調節(jié)機體自身免疫和炎性反應，參與多種生物過程。Jing等[10]發(fā)現，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清PGRN水平升高，體外研究表明PGRN缺乏會導致炎性細胞因子減少，PGRN在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)展中發(fā)揮促炎作用。還有研究表明，PGRN mRNA在正常皮膚組織中幾乎不表達，但在皮膚創(chuàng)傷后迅速呈現高表達水平，可促進炎癥細胞浸潤，延緩創(chuàng)傷愈合的過程[3]。PGRN可以直接作用于真皮成纖維細胞，在傷口愈合過程中可以促進成纖維細胞的增殖和遷移，而越來越多的學者認為真皮成纖維細胞的過度增殖與HS的形成密切相關[11-12]。本研究結果顯示，HS組織的PGRN蛋白陽性表達率及mRNA表達水平均高于正常皮膚組織(均P<0.05)，這表明PGRN在HS的形成中發(fā)揮重要作用。COX-2是誘導型炎性因子，與多種炎癥反應相關。有學者發(fā)現，在HS組織和瘢痕疙瘩組織中均能檢測到COX-2的陽性表達，并且認為局部應用COX-2阻滯劑抑制炎癥反應，可阻斷前列腺素E2的產生，減少瘢痕形成[5]。本研究結果顯示，HS組織的COX-2蛋白陽性表達率及mRNA表達水平均高于正常皮膚組織(均P<0.05)，說明COX-2表達水平升高與HS的形成相關。另外，本研究進一步分析發(fā)現，HS組織中PGRN mRNA表達水平與COX-2 mRNA表達水平呈正相關(P<0.05)。因此我們推測，PGRN、COX-2可能共同在HS的形成機制中發(fā)揮作用，但具體作用機制仍需進一步研究。

IL-1β、IL-6和TNF-α是常見的促炎細胞因子，IL-10是一種重要的抗炎因子。研究表明，IL-1β、IL-6和TNF-α在HS組織中呈高表達水平，IL-10在HS組織中呈低表達[13-14]。本研究結果顯示，HS組織中的IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平均高于正常皮膚組織，IL-10的mRNA表達水平低于正常皮膚組織(均P<0.05)，與上述研究結果一致。這表明這些炎癥細胞因子可能是HS形成過程中的重要調節(jié)因子。本研究進一步分析發(fā)現，HS組織中的PGRN mRNA、COX-2 mRNA表達水平與IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達水平均呈正相關，與IL-10 mRNA表達水平均呈負相關(均P<0.05)，這提示PGRN、COX-2可能通過調控這些炎性因子的產生，參與HS的形成。

綜上所述，與正常皮膚組織相比，HS組織中PGRN、COX-2呈高表達，兩者可能通過調節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的產生，促進炎癥反應，參與燒傷后HS的形成。