現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在木霉鑒定及多樣性分析中的應(yīng)用

董　楠　許艷麗

摘要木霉是一類重要的生防真菌，具有很大的農(nóng)業(yè)應(yīng)用潛力。對分離培養(yǎng)的木霉準(zhǔn)確鑒定，對其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用至關(guān)重要。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)在木霉鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用，本文綜述了rDNA-ITS序列分析、通用引物PCR(UP-PCR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)等分子技術(shù)在木霉鑒定與多樣性分析中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞木霉；DNA寡核苷酸條形編碼；UP-PCR；RAPDAFLP

中圖分類號S 154.3，Q 789

木霉屬真菌(Trichoderma spp.)是一類普遍存在的絲狀真菌，是土壤微生物的重要組成群落之一。該菌易于分離培養(yǎng)、生長迅速，能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶以及蛋白酶等多種酶類，能夠利用多種底物來抵抗某些有害化合物(氰化物等)的毒害。同時(shí)，木霉能夠拮抗多種農(nóng)作物的病原菌、促進(jìn)農(nóng)作物生長、誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗性，是一類重要的植物病害生防菌，具有極大的農(nóng)業(yè)應(yīng)用潛力。目前，全世界已有40多個(gè)國家開展了木霉的相關(guān)研究，已研制出50余種木霉的商品化生防菌劑；我國近年在該領(lǐng)域的研究與應(yīng)用也取得了重要進(jìn)展。

木霉屬真菌是一個(gè)龐大的家族，迄今已鑒定的超過100種，由于每種木霉在生防功能與代謝產(chǎn)物上都不盡相同，因此，對木霉進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定和分類，對其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用至關(guān)重要。傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)方法，即根據(jù)屬間不同種的形態(tài)學(xué)和生殖器官分化特征來鑒定種。然而真菌的形態(tài)性狀復(fù)雜多變且易受環(huán)境影響，同一屬不同種的形態(tài)往往又極其相似，難以區(qū)分，這需要研究者具備豐富的形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)驗(yàn)。現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的介入為木霉的鑒定及分類學(xué)研究開辟了一條新的途徑。人們在分子鑒定方面進(jìn)行了許多嘗試，大大提高了鑒定效率及分類的準(zhǔn)確性。本文就目前國內(nèi)外分子生物學(xué)技術(shù)在木霉鑒定及多樣性分析方面的應(yīng)用進(jìn)行闡述，希望能為木霉的快速準(zhǔn)確鑒定提供幫助。

1核酸序列分析與DNA寡核苷酸條形編碼的應(yīng)用

核酸序列分析是通過測定基因中核苷酸序列的組成來比較同源分子間相關(guān)性的方法，是目前最常用的物種鑒定方法之一。由于某些基因的序列內(nèi)部存在能夠闡明個(gè)體間遺傳關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記(能夠區(qū)別遺傳關(guān)系接近的基因片段，因此有的放矢地分析這些系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，能夠達(dá)到物種分類鑒定及多樣性分析的目的。Kopchinskiy等在NC—BI BLAST的基礎(chǔ)上開發(fā)了TrichoBLAST搜索工具(http：//www.isth.info/tools/blast/index.php)，是用于序列相似性研究的在線數(shù)據(jù)庫，專門用于木霉屬及其有性型肉座菌屬(Hypocrea spp.)物種的序列比對分析和鑒定。其中含有內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS區(qū))、轉(zhuǎn)錄延伸因子I a亞基基因(tefl)及RNA聚合酶第二亞基(rpb2_exon)基因等3類木霉屬與肉座菌屬系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記的數(shù)據(jù)信息。其中，ITS區(qū)(ITSl、5.8s和ITS2)既具保守性，又在科、屬、種水平上具有特異序列，一直被用于真菌的系統(tǒng)進(jìn)化研究；tefl基因是編碼轉(zhuǎn)錄延伸因子I a亞基蛋白的基因，包括3個(gè)系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，分別是第4、第5內(nèi)含子(4th、5th intron)和第6外顯子(6th ex—on)，這3個(gè)標(biāo)記能夠不同程度地區(qū)分物種；rpb2基因也被用于微生物的分類研究中，但使用頻率不及前兩者高。

將待研究序列輸入TrichoBLAST程序中比對，系統(tǒng)將自動(dòng)檢索未知序列中的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，進(jìn)而給出與已知序列具有不同相似程度的物種。這種方法簡單方便，但缺點(diǎn)是給出的結(jié)果是模糊的，需要研究者在比對結(jié)果的基礎(chǔ)上根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷。

為克服這一問題，Druzhinina等在“DNA條形編碼”技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究了用“DNA寡核苷酸條形編碼”(DNA oligonucleotide barcode)對木霉及肉座菌屬的菌株進(jìn)行鑒定的方法，能夠給出確切的鑒定結(jié)果。DNA條形編碼(DNA barcoding)即應(yīng)用單一片段基因序列來區(qū)分所有物種，達(dá)到物種鑒定的目的，如同超市中的條形碼，它隸屬于DNA分類的范疇，用于生物體分類及多樣性研究。自Hebert等提出這一理論以來，該技術(shù)已先后被應(yīng)用于部分動(dòng)物、原生動(dòng)物以及昆蟲的鑒定與分類研究中。Druzhinina等第一次將該理論應(yīng)用到真菌的研究中，他們是在考察了木霉與肉座菌屬88個(gè)菌株的979段序列，共計(jì)135個(gè)ITSl和ITS2單元型序列的基礎(chǔ)上研發(fā)出來的，就是應(yīng)用ITS序列中不同位置上的幾段特異的寡核苷酸序列共同鑒定木霉/肉座菌屬菌株到屬、進(jìn)化支及種的水平，并將不同的序列片段作為定義木霉屬及種的特異性標(biāo)記，以條形碼的形式，存儲(chǔ)在MySQL數(shù)據(jù)庫中，形成TrichOKey v.1.0和2.0程序(www.isth.ifo.TrichOKey v.1.0/2.0)，在線就可查到。該方法能夠鑒定75個(gè)一元種(single species)，5個(gè)二元種(species pairs)以及1個(gè)三元種(speciestriplet)。使用這一程序不但能夠得到未知序列的鑒定結(jié)果，并對鑒定結(jié)果的可靠性進(jìn)行評價(jià)(“high”或“l(fā)OW”)，還能夠獲得該種木霉的屬、進(jìn)化支及種的特異性標(biāo)記，為研究者設(shè)計(jì)特異性引物提供參考。應(yīng)用該方法，作者選取本實(shí)驗(yàn)室保存的20余株不同培養(yǎng)性狀的木霉進(jìn)行鑒定，共鑒定出6個(gè)木霉種(T，har-zianum、T.viride、T.citrinoviride、T.virgns、T.aggressivum、T.pseudokoningii)；并根據(jù)特異性標(biāo)記設(shè)計(jì)了木霉屬特異性擴(kuò)增引物(未發(fā)表)。

作為一種分子鑒定手段，該方法的優(yōu)點(diǎn)為：(1)快捷性：能夠給出確切的鑒定結(jié)果，這是它區(qū)別于BLAST的主要方面。(2)方便性：該程序充分考慮到使用者，即便使用者對木霉屬與肉座菌屬的分類情況知之甚少，也能夠方便地獲得鑒定結(jié)果，極大地提高了鑒定效率。(3)準(zhǔn)確性：TrichOKey v.1.0/20數(shù)據(jù)庫中包含5個(gè)屬特異性標(biāo)記及若干個(gè)種特異性標(biāo)記，能夠使研究者從每一步來檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2通用引物PCR結(jié)合交叉印跡雜交方法鑒定木霉屬真菌

通用引物PCR(Universally Primed PCR，UP-PCR)是一種PCR指紋圖譜技術(shù)，類似于RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)，可用于基因組結(jié)構(gòu)研究、物種鑒定、種間與種內(nèi)遺傳關(guān)系分析以及種群多樣性研究，將其與SCAR(特異序列擴(kuò)增)標(biāo)記技術(shù)結(jié)合使用，可用于監(jiān)測釋放到環(huán)境中的生防菌株。它的基本原理是根據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，用人工合成的一段16bp以上的通用引物，對待研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯

酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，形成PCR指紋圖譜，利用擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性進(jìn)行物種鑒定及多樣性分析。

由于木霉菌株擁有高度的基因組相似性，電泳后可以清晰地將種特異性條帶顯現(xiàn)出來，從而將不同種的木霉菌株分開，再將其指紋圖譜與已知種的圖譜進(jìn)行比較，即可鑒定出未知菌株。如果指紋圖譜與參考菌株的條帶圖有很大差異，可以進(jìn)一步結(jié)合交叉印跡雜交(cross blot hybridization)的方法來研究未知菌株與參考菌株的同源性，進(jìn)而確認(rèn)種。

與RAPD技術(shù)相比，UP—PCR方法的主要優(yōu)點(diǎn)是：退火溫度更高(約55℃)，引物更長(＞16bp)，產(chǎn)生的條帶更復(fù)雜(最多可達(dá)100條)，重復(fù)性更好，這些都克服了RAPD技術(shù)的缺點(diǎn)。國際木霉與肉座菌屬分類委員會(huì)網(wǎng)站上對該方法有系統(tǒng)闡述，包括引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件等。Lubeck等最先應(yīng)用該方法研究木霉與粘帚菌(Gliocladiumspp，)的親緣關(guān)系，認(rèn)為該方法具有區(qū)別親緣關(guān)系相近菌株的能力；并將其用于鑒定丹麥建筑物污水中分離出的44株木霉，共鑒定出6個(gè)木霉種(T.atroviride、T.citrinoviride、T.harzianum、T.kongibrachiatum、T.viride和T.hamatum)，分別屬于3個(gè)不同的進(jìn)化組(section Longibrachia—turn、section Pachybasium和section Trichoder—ma)。他們認(rèn)為該方法可用于區(qū)分木霉的集合種(Trichoderma viride/atroviride/koningii)，并可發(fā)展成為木霉菌株的常規(guī)鑒定方法。近年來，UP-PCR方法除用于木霉種的鑒定外，還被用于植物病原菌及其他生防菌的多樣性分析，如立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)和粉紅聚孢霉(Clonos—tachys rosea)等。

3RAPD技術(shù)在木霉鑒定及多樣性分析中的應(yīng)用

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified poly—morphic DNA，RAPD)技術(shù)是目前在真菌多樣性分析中應(yīng)用最為廣泛的一種分子生物學(xué)方法之一。其基本原理是應(yīng)用隨機(jī)引物對目標(biāo)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分離，擴(kuò)增產(chǎn)物所呈現(xiàn)的不同條帶圖譜，反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。在木霉的遺傳多樣性與種群多樣性分析中，RAPD技術(shù)也是應(yīng)用最早，研究成果最多的一種分析手段，進(jìn)而被用于木霉的分子鑒定。Dubey等應(yīng)用RAPD方法分析具有生防作用的木霉，找到能夠有效區(qū)分3種生防木霉(T.viride、T.harzianum及T.virens)的RAPD引物。Singh等研究了引起蘑菇病害的18株木霉，通過結(jié)合ITS序列比對方法鑒定為T.harzianum和T.virens，并應(yīng)用RAPD分析了其種間及種內(nèi)多樣性。李梅云等運(yùn)用RAPD技術(shù)對18個(gè)木霉菌株的基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，認(rèn)為RAPD遺傳標(biāo)記木霉可以作為該菌分類的有效手段之一。

與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，RAPD具有以下特點(diǎn)：①PCR反應(yīng)靈敏度高、樣品用量少；②引物具有通用性，無需預(yù)知物種DNA序列；③操作簡便迅速，實(shí)驗(yàn)成本低，無放射性污染；缺點(diǎn)是重復(fù)性差。近年來，RAPD技術(shù)與多種指紋圖譜分析軟件相結(jié)合，提高了對不同物種種問及種內(nèi)多態(tài)性確認(rèn)的準(zhǔn)確性，在鑒定大量樣品時(shí)，在不能將所有樣品進(jìn)行測序的情況下應(yīng)用RAPD技術(shù)，其操作簡便且試驗(yàn)成本低的特點(diǎn)，可以極大地提高鑒定效率。

4AFLP技術(shù)分析木霉多樣性

1995年Vos和Zabeau等建立了擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified restriction fragment polymorphism，AFLP)方法。它是基于PCR反應(yīng)的一種選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法。用限制性內(nèi)切酶酶切不同菌株的基因組DNA，產(chǎn)生大小不同的限制性片段，使用人工接頭將其連接，作為模板。用含有選擇性堿基的引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，根據(jù)DNA指紋圖譜的差異來檢驗(yàn)多態(tài)性。該方法廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析及品質(zhì)鑒定等方面的研究。

Buhariwalla等首先將該技術(shù)應(yīng)用于分離自印度4個(gè)花生種植地的48株木霉的多樣性分析及種質(zhì)鑒定中，并結(jié)合28S rDNA序列分析技術(shù)，通過6對引物的聯(lián)合使用，共得到234個(gè)多態(tài)性條帶，鑒定出8個(gè)木霉種(T.pubescens、T.hamatum、T.koningii、T.viride、T.atroviride、T.longi—brachiatum、T.inhamatum及T.harzianum)。他們認(rèn)為AFLP條帶能夠?qū)δ久狗N及黃曲霉種進(jìn)行鑒定，區(qū)別親緣關(guān)系相近的種，擴(kuò)增子能夠用于診斷分離到的生防木霉。

該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是：(1)多態(tài)性豐富，很少的引物即可獲得50～100條擴(kuò)增條帶；(2)受環(huán)境影響小，多為共顯性表達(dá)、無復(fù)等位效應(yīng)；(3)靈敏度高，重復(fù)性好，帶形穩(wěn)定；(4)無需已知DNA序列；主要缺點(diǎn)是：分析費(fèi)用高，操作復(fù)雜；對DNA純度及內(nèi)切酶質(zhì)量要求高。

綜上所述，在木霉的分子鑒定與多樣性研究中，不斷有研究者將新的方法應(yīng)用到該領(lǐng)域；并將其加以改進(jìn)，不斷完善。表1總結(jié)了上述4種方法的主要特點(diǎn)，還有其他鑒定方法在木霉研究中應(yīng)用不多，這里不再贅述。依據(jù)這些特點(diǎn)，人們可以根據(jù)其試驗(yàn)?zāi)康募霸囼?yàn)條件加以選擇，從而得到準(zhǔn)確的鑒定與分析結(jié)果。

5展望

隨著核酸測序技術(shù)的普及及各種分子標(biāo)記方法的不斷完善與發(fā)展，在微生物研究領(lǐng)域中，對于微生物的鑒定已經(jīng)從依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定的時(shí)期逐步過渡到依靠分子生物學(xué)手段進(jìn)行種質(zhì)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析的研究階段，但這并不能取代傳統(tǒng)的鑒定方法，而是對生理生化及形態(tài)學(xué)方法的補(bǔ)充。每種方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)與不足，都需要其他鑒定信息的互相印證才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。在科技迅猛發(fā)展的今天，一些新興的分子生物學(xué)技術(shù)也將逐步應(yīng)用到木霉的監(jiān)測及多樣性分析之中，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time PCR)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)等。Cordier等將RAPD、SCAR及real time PCR技術(shù)相結(jié)合，用于檢測Trichodermaatroviride生防菌株在土壤中的生長繁殖情況；Yergeau等應(yīng)用DGGE技術(shù)對蘆筍中鐮刀菌屬的種群多樣性進(jìn)行研究，相信在不久的將來這一方法也能夠應(yīng)用到木霉的多樣性分析中。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為木霉屬真菌的分類鑒定提供了一條嶄新的途徑，極大地促進(jìn)了木霉分類學(xué)的發(fā)展，提高了鑒定效率，使快速準(zhǔn)確鑒定成為可能。近年來，隨著人們對可持續(xù)發(fā)展及綠色農(nóng)業(yè)要求的逐步提高，木霉作為重要的土壤生防因子必將得到進(jìn)一步的研究與應(yīng)用，對木霉鑒定方法的深入探討，不但能夠促進(jìn)木霉的分類與生防作用的研究，也必將對其物種與多樣性、生態(tài)學(xué)與地理分布等多方面的研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。