ＨＰＬＣ法檢測闌尾靈顆粒芍藥苷含量的方法的建立

摘要：目的：建立HPLC法測定闌尾靈顆粒中的芍藥苷含量；方法：采用C18柱，以甲醇-水-磷酸（27：73：0.1）為流動(dòng)相，檢測波長為230nm。結(jié)果：該方法簡便，準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。平均加樣回收率為100.92%，RSD為1.27%。結(jié)論：該方法可做為闌尾靈顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：HPLC;闌尾靈顆粒;芍藥苷

闌尾靈顆粒收載于中華人民共和國衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二十冊[1]。具有清熱解毒，瀉下通便，破閼散結(jié)，理氣止痛的功效。用于急性單純性闌尾炎(瘀滯型)；急性化膿性闌尾炎早期(蘊(yùn)熱型)。臨床療效明顯，深受患者喜愛。為保證其質(zhì)量的可控性，經(jīng)研究建立了用高效科學(xué)液相法測定闌尾靈顆粒中芍藥苷的含量測定方法。

1儀器、試藥及試劑

1.1 儀器：Waters高效液相色譜儀；N2000色譜工作站（浙江大學(xué)）；Waters 746型積分儀; Waters 486檢測器。島津UV2401PC 可見紫外分光光度計(jì)；賽多利斯Bp211D分析天平；KQ600B型超聲波振蕩儀（江蘇昆山）。色譜柱：Hypersil BDS C18 （5μm.. 4.6mm×250mm）。

1.2 試藥：芍藥苷對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)：0736－200014），甲醇：色譜純（Fisher公司）； 磷酸：分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心） ；水：超純水。闌尾靈顆粒 (哈藥集團(tuán)中藥二廠)（批號(hào)：20010101，20010102，20010103）

1.3．提取方法確定

提取溶媒的選擇。在供試品溶液制備中，分別選用了95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明：70%甲醇分離效果、峰形及含量均為最好，所以選擇70%甲醇進(jìn)行超聲提取。

提取時(shí)間的選擇。取供試品適量，用70％甲醇溶解，超聲波振蕩分別提取20、25、30分鐘，制備供試品溶液，結(jié)果表明：三種提取時(shí)間結(jié)果無明顯差異，為保證提取完全，采用超聲提取30分鐘。

檢測條件的選擇

波長選擇：取芍藥苷對(duì)照品適量，加70%甲醇溶解，用PERKINELMEBDA 3B紫外檢測分光光度儀進(jìn)行全波長掃描，在230 nm處有最大吸收，故其最大吸收峰位于230nm處，與《中國藥典》2005年版一部[2]赤芍藥材項(xiàng)下的含量測定標(biāo)準(zhǔn)一致，因此將檢測波長定為230nm。

流動(dòng)相的選擇：先后試用甲醇-水（30：70）、甲醇-水-磷酸（20：80：0.07）、甲醇-水-磷酸（25：75：0.1）及甲醇-水-磷酸（27：73：0.1）四種比例的流動(dòng)相。只有流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸（27：73：0.1）時(shí)，成品中芍藥苷與其它組分均能達(dá)到基線分離。

檢測條件：根據(jù)上述考查的結(jié)果，確定流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸（27：73：0.1），檢測波長為230nm，流速為1.0ml/min。

1.4 陰性干擾試驗(yàn)：在處方中去除赤芍、牡丹皮藥材，按方中比例和制備工藝方法制成陰性制劑，用供試品溶液制備的方法，制成陰性對(duì)照溶液，用以上選定的測定條件進(jìn)行吸收曲線繪制，觀察在與芍藥苷相同的保留時(shí)間處是否存在吸收峰，結(jié)果表明：在選定條件下測得的陰性液吸收曲線在與芍藥苷相同保留時(shí)間處不存在吸收峰，因此說明選定的條件測定芍藥苷無干擾，具有較強(qiáng)的專屬性。

2. 方法與結(jié)果

2.1線性考察試驗(yàn) 精密稱取芍藥苷對(duì)照品18.85mg，置50ml量瓶中，用70％甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻。進(jìn)樣量分別為2、5、8、11、14、17μl，按含量測定方法測定峰面積，并以峰面積的積分值為橫坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。回歸方程為：y=1915305.357X＋8373.404372（r=0.999 4），芍藥苷在0.149μg～1.2665μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗(yàn)精密稱取芍藥苷18.85mg，置50ml量瓶中，加70%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇溶解，并稀釋至刻度，連續(xù)6次等量注入同臺(tái)液相色譜儀中進(jìn)行測定，考察其精密度，結(jié)果見表1：

由表1可見，此含量測定方法的精密度良好。

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)分別稱取同批闌尾靈顆粒樣品6份，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下方法測定含量，并計(jì)算樣品的RSD值，結(jié)果見表2:

由表2可見，此含量測定方法的重現(xiàn)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品，按正文含量測定方法測定后，樣品置室溫下放置，每間隔2小時(shí)測定1次，連續(xù)測4次，測定結(jié)果的RSD=2.16%。證明供試品制備后10小時(shí)內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。測試結(jié)果見表3。

由表3可見，此含量測定方法的穩(wěn)定性良好。

2.5加樣回收試驗(yàn)

對(duì)照品溶液配制：取芍藥苷18.85mg，70％甲醇溶解并定容至50ml，搖勻，即得。本對(duì)照品溶液濃度為0.377mg/ml。

精密稱取已知含量（含量為7.1832mg／g）的樣品6份，每份約0.15g，分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液3ml（相當(dāng)于對(duì)照品1.131mg），按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4：

結(jié)果表4表明，本檢測方法具有較好的回收率。

2.6含量限度的確定按本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)下方法，測定了十批樣品，結(jié)果見表5：

結(jié)果表明，樣品中芍藥苷的含量差異，每克樣品含赤芍、牡丹皮以芍藥苷計(jì)均大于4.2mg，且3批樣品含量的平均值為5.2，5.2×80%=4.16，因此規(guī)定闌尾靈顆粒中含赤芍、牡丹皮以芍藥苷計(jì)均大于4.0mg。即每袋芍藥苷含量不低于45mg。

結(jié)果 該方法測定芍藥苷含量重現(xiàn)性好，靈敏度高，可以作為闌尾靈顆粒質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部，藥品標(biāo)準(zhǔn)，中藥成方制劑，第二十冊。

[2] 中國藥典[S]，2005年版，一部。