生長(zhǎng)因子緩釋微球的制備及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響

[摘要]目的：制備堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF） 可降解緩釋微球，考察其生物活性的保存情況及它們對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。方法：采用改良的乳化冷凝法交聯(lián)制備復(fù)合bFGF、VEGF 的明膠緩釋微球，將它們加入內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、四甲基偶氮唑鹽微量反應(yīng)比色法(MTT法)測(cè)定細(xì)胞增殖情況。結(jié)果：復(fù)合bFGF、VEGF的緩釋微球平均粒徑（11.32±3.64）μm;培養(yǎng)1天后各組細(xì)胞計(jì)數(shù)、吸光度(A)值差異均無(wú)顯著性;5天后兩種生長(zhǎng)因子緩釋微球組細(xì)胞計(jì)數(shù)、吸光度(A)值明顯高于對(duì)照組;7天后兩種生長(zhǎng)因子緩釋微球組值仍高于其它組。結(jié)論：復(fù)合bFGF、VEGF的緩釋微球制備工藝簡(jiǎn)便，具有良好的緩釋活性能較長(zhǎng)時(shí)間地持續(xù)釋放活性bFGF、VEGF，可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；微球；明膠；緩釋系統(tǒng)；內(nèi)皮細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2007）11-1538-05

The preparation of growth factors-impregnated microsphere and its effect on endothelial cells

WANG Lu，GUO Shu-zhong，SUI Ji-qiang，MA Xian-jie，SONG Bao-qiang，YI Cheng-gang

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo prepare the bFGF、 VEGF- impregnated microsphere and to investigate its bioactivity and its effect on endothelials.MethodsThe bFGF、 VEGF - impregnated microsphere was prepared by emulsified cold -condensation method and was added to the RPMI 1640 medium. The proliferation of cultured endothelials were measured by cell counting and MTT method.ResultsThe average diameter of microsphere was(11.32±3.64)μm; the in vitro cellular study showed no significant difference in the cell number and cell viability of 4 groups 1 day after plate culture. The cell number and cell viability in bFGF、VEGF - impregnated microsphere group were more than those in other groups 5 days after plate culture. 7days after plate culture，the cell number and cell viability in bFGF、 VEGF - impregnated microsphere group were still higher.ConclusionThe preparing method is simple and accurate ， the bFGF、 VEGF- impregnated microsphere can promote the proliferation of endothelials through a long period ofbFGF、 VEGF sustained - release.

Key words:fibroblast growth factors;vascular endothelial growth factors;microspheres;gelatin;sustained-release system; endothelial cells

組織移植是整形外科常用的治療手段之一， 用于各種組織缺損的修復(fù)，也可以作為組織填充的材料，改善患者的外貌和體形。移植組織需要在受區(qū)重新建立血運(yùn)，而在重新建立血運(yùn)之前處于缺血狀態(tài)，但組織的耐缺血時(shí)間是有限的，如果不能及時(shí)建立血液循環(huán)，將會(huì)導(dǎo)致移植組織缺血壞死。利用生長(zhǎng)因子局部應(yīng)用促進(jìn)血運(yùn)重建取得了一定的效果，但外源性生長(zhǎng)因子半衰期短，一次給藥效果不甚理想。

采用微球系統(tǒng)控制生長(zhǎng)因子局部釋放是解決上述問(wèn)題的一種有效方法。近年來(lái)，利用緩釋系統(tǒng)延長(zhǎng)生長(zhǎng)因子局部作用時(shí)間促進(jìn)血管新生，從而促進(jìn)移植組織的血運(yùn)重建是整形外科最活躍的研究領(lǐng)域之一。本實(shí)驗(yàn)制備VEGF及bFGF的明膠緩釋微球并作用于內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、細(xì)胞活力檢測(cè)法，檢測(cè)緩釋微球的緩釋活性及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用。 為臨床提供一種促進(jìn)移植組織血運(yùn)重建的新方法，并為組織工程的發(fā)展奠定一定的基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 試劑與設(shè)備：bFGF、VEGF(珠海億勝生物制藥有限公司)、RPMA1640 復(fù)合培養(yǎng)液(美圍Gileco公司)、明膠(等電點(diǎn)50，相對(duì)分子量99 000， Sigma)、胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)、噻唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司)、 美國(guó)Bio-RAD Model 550酶標(biāo)分析儀、日本H600-1V型透射電鏡、美國(guó)FJ一2003型計(jì)數(shù)儀。自制bFGF-明膠微球、VEGF-明膠微球。人bFGF /VEGF定量ELLISA試劑盒(QuantiKineR， RDsystems)， 250g/L戊二醛，丙酮，異丙醇，無(wú)水乙醚，液體石蠟，氨基乙酸為國(guó)產(chǎn)分析純，Span-80(Sigma公司)為進(jìn)口分析純，水為雙蒸水，JJ21型精確電子攪拌器儀， TGL216G高速離心機(jī)，GENESIS凍干機(jī)(Virtis公司)，BX241數(shù)碼顯微鏡(Olympus)。ECV304內(nèi)皮細(xì)胞系購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心。

1.2方法

1.2.1 bFGF-明膠微球的制備：將含有10g/L Span-80的液體石蠟30ml置于三口瓶中預(yù)熱至55℃，快速攪拌下滴加入同樣溫度的明膠水溶液4ml，并調(diào)節(jié)攪拌速度至450r/min，繼續(xù)攪拌10 min；形成油包水乳劑后迅速改冰浴，攪拌10min，使其完成固化；加入250g/L戊二醛0.1ml，攪拌下預(yù)固化2h，而后4℃固化24h，用丙酮、異丙醇、乙醚洗滌，揮去乙醚，真空干燥，得到粉末狀淡黃色微球。用雙蒸水洗凈有機(jī)溶劑并凍干。將200μl的bFGF溶液滴加在20mg的凍干明膠微球上，在4℃保持24h以使bFGF完全融入微球。鈷-60照射滅菌封存。將生理鹽水浸泡過(guò)的明膠微球涂片置于光鏡下，觀察其外形及分散度，同時(shí)測(cè)量膨脹系數(shù)。電鏡下測(cè)量500個(gè)微球的直徑計(jì)算其平均粒徑。以算術(shù)平均徑為微球的平均粒徑，計(jì)算公式為：平均粒徑= n1 d1+n2 d2+……+nn dn/n1+n2+n3+……+nn，式中n1，n2……nn為粒子數(shù)，d1，d2……dn為粒徑。

1.2.2 VEGF- 明膠微球的制備（同1.2.1）

1.2.3 bFGF/VEGF 緩釋微球的體外釋藥實(shí)驗(yàn)：根據(jù)人bFGF/VEGF ELISA試劑盒說(shuō)明用酶聯(lián)免疫儀于490nm測(cè)定吸光度值(A值)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.取微球樣品10mg，放入PBS(pH7.4)緩沖液中，完全溶解后定容至100ml，取10μl另加90μl共100μl測(cè)出A值。由此計(jì)算出微球的載藥率和包封率。載藥率=(投藥量-上清液中藥量)/微球重量×100%；包封率=(投藥量-上清液中藥量)/投藥量×100%。

動(dòng)態(tài)透析法進(jìn)行體外釋藥實(shí)驗(yàn)，將制備的復(fù)合緩釋微球10mg混懸于PBS(pH7.4)100ml中，置于37℃水浴搖床(135r/min)分別于各時(shí)間點(diǎn)(1，2，3，4，5，6，7天)取上清液100μl，測(cè)量其濃度，繪制復(fù)合微球釋藥曲線。

1.4 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組：將購(gòu)買(mǎi)的內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞系培養(yǎng)至鋪滿瓶底后，用0.25％胰酶消化5min，用含10％胎牛血清的RPMI 1 640終止胰蛋白酶作用。吸管吹散細(xì)胞團(tuán)塊以獲取單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞。將懸浮細(xì)胞接種于25ml培養(yǎng)瓶，細(xì)胞密度為5×105/瓶，置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合成單層后再傳5代培養(yǎng)備用。實(shí)驗(yàn)分為四組：A組培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)10％小牛血清+20ng／ml VEGF、bFGF緩釋微球劑的RPMI 1 640，B組培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)10％小牛血清+20ng／ml VEGF緩釋微球劑的RPMI1640，C組培養(yǎng)液為體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+20ng／ml bFGF緩釋微球劑的RPMI 1 640，D組培養(yǎng)液為體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+與A組等量的空白微球的RPMI 1 640(空白對(duì)照組)。

1.5 VEGF、bFGF緩釋微球?qū)?nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響：取第5代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，以1×107／L接種于24孔板，使細(xì)胞長(zhǎng)同步后按實(shí)驗(yàn)分組換成不同的培養(yǎng)液分別于培養(yǎng)1、3、5、7天收集細(xì)胞，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)測(cè)量孔，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。

1.6 VEGF、bFGF緩釋微球?qū)?nèi)皮細(xì)胞活力的影響[四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)：取第5代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，以1×107／L密度接種到96孔板，每孔200μl，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步后按實(shí)驗(yàn)分組換成不同的培養(yǎng)液。分別于培養(yǎng)1、3、5、7天按常規(guī)先后加入四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)設(shè)4個(gè)重復(fù)測(cè)量孔，用酶標(biāo)分析儀依次檢測(cè)每孔吸光度（A)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。

1.7 統(tǒng)汁學(xué)分析：結(jié)果以x±s表示：采用SPASS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，四組均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用單向方差分析(One-wayANOVA)。以P<0．05為差異有顯著性意義。

2結(jié)果

2.1 bFGF-明膠微球、VEGF-明膠微球的表觀，膨脹系數(shù)及平均粒徑光鏡下及掃描電鏡觀察可見(jiàn)制備的復(fù)合bFGF、VEGF緩釋微球干粉球體分散度良好，呈圓球體， 徑粒較均勻。微球在生理鹽水中的膨脹系數(shù)為1.3(直徑)，呈球型，無(wú)粘連，無(wú)塌陷或萎縮現(xiàn)象。干燥狀態(tài)的微球表面有少量顆粒狀吸附物，但未見(jiàn)微孔和裂紋， 如圖（1～4）。在掃描電鏡下測(cè)得微球粒徑呈正態(tài)分布，大部分為10～28μm，占86.7%，平均粒徑為（11.32±3.64）μm。凍干粉劑為淡黃色疏松粉末。加雙蒸水后為淡黃色乳狀溶液。再分散性良好。

2.3 緩釋微球體外釋放度：根據(jù)測(cè)定的A值，計(jì)算出微球的平均載藥率為0.26%，包封率為90.6%，載藥微球的釋藥速度主要取決于藥物的擴(kuò)散速度和載體材料的降解速度，明膠微球在pH＞7.0時(shí)完全降解約需2月。復(fù)合微球具有良好的緩釋性能，如圖所示，微球在釋藥初期速度較快，而后速度減緩平穩(wěn)釋放，7天后累計(jì)釋放93%。

2.3VEGF、bFGF緩釋微球?qū)?nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響：各組計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。培養(yǎng)1天 后，各組內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)差異均無(wú)顯著性(F檢驗(yàn)，P>0.05)；3天時(shí)，各組內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)較，A組>B組>C組>D組，各組間差異均有顯著性差異(q檢驗(yàn)，P<0.05)；培養(yǎng)5天后，緩釋微球A組細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組(q檢驗(yàn)，P<0.05)；7天后，A組值仍比其他組高，組間差異與5天時(shí)相仿。

2.4 VEGF、bFGF緩釋微球?qū)?nèi)皮細(xì)胞活力的影響：各組內(nèi)皮細(xì)胞A 值的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表-2，培養(yǎng)1天 后，各組A 值間差異無(wú)顯著性(F檢驗(yàn)，P>0.05)；3天 時(shí)，各組A值比較， A組>B組>C組>D組，B組與C組間差異有顯著性(q檢驗(yàn)，P<0.05)；培養(yǎng)5天 后，各組A 值依次為：A組>B組>C組>D組，緩釋微球組A 值明顯高于對(duì)照組(q檢驗(yàn)，P<0.05)；7天后，各組A值間差異與5天時(shí)相仿。

3討論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一類調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的多肽， 能選擇性地作用于EC，是EC的特異性有絲分裂原，促進(jìn)其增殖、遷移進(jìn)而導(dǎo)致新生血管形成。可以改變EC的某些基因表達(dá)、促使EC分泌組織因子、膠原酶等，從而改變內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)，有利于血管生成。

VEGF家族及其受體(FLT-1、KDR／FLK-1、FLT-4)被認(rèn)為是血管生成和血管滲透性的基本調(diào)節(jié)因子。在腫瘤、缺血缺氧等情況下，VEGF及其受體呈現(xiàn)高表達(dá)；而VEGF不足時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血管腔閉合、血管退化。

bFGF是目前已知最強(qiáng)的促細(xì)胞生成因子，在促血管生成、創(chuàng)傷愈合和組織損傷修復(fù)過(guò)程中作用巨大，同時(shí)也在胚胎發(fā)育以及腫瘤的形成過(guò)程中有重要的作用。bFGF有兩個(gè)主要功能，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞萌芽、增殖，增加血管通透性。bFGF可通過(guò)誘導(dǎo)EC 等細(xì)胞， 使之表達(dá)組織重建所需的纖溶酶原激活劑、膠原酶及核蛋白水解酶。上述物質(zhì)可降解新生血管起始緣的基底膜及周?chē)|(zhì)，為細(xì)胞遷移并侵入周?chē)M織掃清障礙。實(shí)驗(yàn)證明bFGF誘導(dǎo)的EC產(chǎn)生尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(u-PA)在血管新生的早期起中心作用。

組織創(chuàng)傷部位含有多種生長(zhǎng)因子和不同生長(zhǎng)因子的受體，當(dāng)一種生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入適當(dāng)周期后，加入其他生長(zhǎng)因子或是多種生長(zhǎng)因子合用于同一環(huán)節(jié)，可加強(qiáng)細(xì)胞分裂增殖能力。VEGF 和bFGF都是血小板相關(guān)生長(zhǎng)因子，在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中具有協(xié)同作用，在傷口血管再生早期，內(nèi)皮細(xì)胞由bFGF誘導(dǎo)，后期毛細(xì)血管的生長(zhǎng)和分化由VEGF調(diào)節(jié)。用兩者共同刺激體外培養(yǎng)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在同樣的條件下，其細(xì)胞數(shù)目要比單獨(dú)用任何一種時(shí)多2～8倍[1]。SeShezzi 等很早就發(fā)現(xiàn)bFGF能上調(diào)VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，主要通過(guò)細(xì)胞的自分泌和旁分泌途徑[2]。已經(jīng)知道通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 打開(kāi)內(nèi)皮細(xì)胞間的連接和使細(xì)胞增殖，是VEGF和bFGF信號(hào)的共同通路，P44/22 MAPK就是這條共同通路中的一個(gè)信號(hào)蛋白[3]。Tokuda 等進(jìn)一步研究了bFGF 和VEGF 之間的協(xié)同機(jī)制，先前發(fā)現(xiàn)bFGF 激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) P44/P42 提高VEGF 的釋放，最近他們又發(fā)現(xiàn)應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK) 的磷酸化是bFGF增強(qiáng)VEGF 表達(dá)的重要酶， 且SAPK比P44/P42 MAPK更為重要[4]。早在1986 年Lawrence 就聯(lián)合應(yīng)用TGF-β、PDGF和EGF3種蛋白治療阿霉素造成的難治性潰瘍，取得好的療效。而薛斌等聯(lián)合應(yīng)用VEGF和bFGF蛋白注射大鼠缺血皮瓣皮下促進(jìn)了缺血皮瓣的存活，皮瓣的成活面積/血管數(shù)目明顯高于兩種因子單獨(dú)應(yīng)用，兩種因子聯(lián)合使用能明顯提高其促血管生成能力[5]。

由于生長(zhǎng)因子穩(wěn)定性差，生物膜透過(guò)性差， 局部作用半衰期短，如bFGF在體內(nèi)的半衰期僅為3～10min，直接應(yīng)用效果不佳，而緩釋微球載體作為新型藥物緩釋控釋系統(tǒng)之一，具有緩釋藥物、靶向輸送、在保證藥物治療作用的前提下減少給藥劑量，降低藥物毒性等優(yōu)點(diǎn)[6]是解決辦法之一。明膠是天然高分子生物材料，組織相容性好，可被組織吸收；在未吸水前耐高溫，可高溫消毒；吸水膨脹軟化后，溶點(diǎn)不超過(guò)30℃，具有廉價(jià)易得、無(wú)抗原性、摩擦系數(shù)低、在體內(nèi)可自然降解等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于多種藥物劑型中[7]。明膠是氨基酸與肽類交聯(lián)形成的直鏈聚合物，能進(jìn)行多種表面修飾及反應(yīng)，制備時(shí)可根據(jù)不同要求設(shè)計(jì)。而且明膠中含有RGD生物活性短肽有利于細(xì)胞表面粘附分子識(shí)別。

微球制備采用改良的乳化冷凝法，其機(jī)制是等電點(diǎn)為5.0 的酸性明膠在水中溶解后，分子伸展為纖維狀，在冷凍脫水的條件下卷曲，并由多個(gè)分子凝聚成球狀微粒，在固化劑(戊二醛) 的作用下，明膠分子呈穩(wěn)定性良好的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并與荷電性相反的堿性bFGF 通過(guò)離子間的相互作用形成較為穩(wěn)定的PECs[8]，兩者間形成一定的親和力，bFGF 被明膠吸附并包裹于微球中，隨著明膠的降解，實(shí)現(xiàn)bFGF在體內(nèi)的控制釋放。而且在凍干過(guò)程中，明膠還可以取代水而與多肽形成氫鍵來(lái)穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象，從而保護(hù)因子活性. 明膠微球?yàn)閷?shí)體微粒，被包裹藥物釋放相對(duì)緩慢，足以達(dá)到緩釋的要求[9]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合bFGF、VEGF 緩釋微球?qū)?nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和活力影響：空白對(duì)照組的微球成分對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和活力無(wú)影響，緩釋載體安全可靠。培養(yǎng)1天后各組細(xì)胞計(jì)數(shù)、吸光度(A)值差異無(wú)顯著性；5天后復(fù)合緩釋微球組細(xì)胞計(jì)數(shù)、吸光度(A)值明顯高于對(duì)照組；7天后復(fù)合緩釋微球組值仍高于其他組。結(jié)果表明使用bFGF、VEGF的最初24h內(nèi)作用不明顯；培養(yǎng)初期緩釋微球組釋放的bFGF、VEGF數(shù)量較少，促細(xì)胞增殖作用較對(duì)照組差異性不大，培養(yǎng)5天后，緩釋微球組持續(xù)釋放具有生物活性的bFGF、VEGF，而且在他們的協(xié)同作用下促增殖作用最強(qiáng)；培養(yǎng)7天后，雖然緩釋微球組仍在釋放bFGF、VEGF，雖然速度已經(jīng)減慢且此前緩釋出的部分bFGF、VEGF 生物活性遭到破壞，但其釋放出的生長(zhǎng)因子仍有促增殖作用，兩種因子協(xié)同作用效果明顯。

由于多肽的不穩(wěn)定性，研究中如何保證生長(zhǎng)因子持續(xù)高效作用是研究的難點(diǎn)之一，應(yīng)用微球系統(tǒng)控制緩釋多肽類藥物是目前較為簡(jiǎn)單有效和安全的辦法。如何提高微球的載藥量，延長(zhǎng)藥物的持續(xù)釋放時(shí)間及如何與其他組織工程支架復(fù)合修復(fù)重建組織損傷還需要進(jìn)一步深入研究。此外多種生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用的選擇與應(yīng)用的比例及時(shí)間策略也需要更加深入的探究。

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[收稿日期]2007-08-15[修回日期]2007-11-02

編輯/張惠娟