軟骨蛋白聚糖研究進展

王正輝 綜述 楊壯群 賀西京 審校

軟骨組織存在于機體的許多部位，透明軟骨是軟骨的主要形式，普遍存在于骨骼系統(tǒng)中，如胚胎時期的骨生成始基、幼年個體發(fā)育期引導骨增長的生長板以及關(guān)節(jié)的骨軟骨負重面等。所有的透明軟骨都含有大量的特征性物質(zhì)蛋白聚糖（proteoglycan，PG），它主要以透明質(zhì)酸和連接蛋白合成的蛋白聚糖聚合物形式存在，在軟骨中通過其滲透性使軟骨膨脹以抵抗軟骨所受的壓縮力。自20世紀80年代中期以來，蛋白聚糖在軟骨損傷中的降解機制就一直為研究的熱點[1]。

1蛋白聚糖的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 蛋白聚糖聚合物：蛋白聚糖聚合物(aggrecan)是一種有多個功能域的模板蛋白聚糖，其核心蛋白有三個球形區(qū)域，由G1、G2、G3組成，每個域都含有半胱氨酸殘基并以氫鍵連接，G1和G2由球間域分隔，G2和G3間有糖胺聚糖(GAG)附著區(qū)，其中富含硫酸軟骨素(CS)和硫酸角質(zhì)素(KS)。G1位于核心蛋白的氨基端，可分為三個功能域A、B1、B2，B型域和透明質(zhì)酸（HA）有交互作用；G2也有兩種B型域，但與HA無相互作用，目前其功能尚不明確；G3位于核心蛋白的羧基端，含有多種特殊結(jié)構(gòu)域，它對于蛋白聚糖核心蛋白正常的翻譯后加工及后續(xù)的蛋白聚糖分泌作用是不可少的。GAG附著區(qū)由三個可附著CS和KS的域組成。

蛋白聚糖分子并非孤立地存在于細胞外基質(zhì)中，而是以aggrecan形式存在［2］。每個aggrecan都由位于中心的透明質(zhì)酸鏈和其發(fā)出的100個蛋白聚糖分子組成，相互之間以連接蛋白連接加以穩(wěn)固。巨大的aggrecan分子在組織中被膠原支架包裹從而使蛋白聚糖穩(wěn)定于胞外基質(zhì)中［2］。軟骨中aggrecan很少以完整的形式存在，取而代之的是受細胞外蛋白酶解加工的核心蛋白，最終產(chǎn)生的aggrecan不是完整的蛋白聚糖分子［3］。參與aggrecan代謝的生物大分子很多，降解代謝最重要的兩種酶是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和多聚蛋白聚糖酶(aggrecanaes)[4]，而合成代謝中最重要的是組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)[5]和α2巨球蛋白[6]。這四種生物大分子之間的相互作用和制約維持著PG的代謝平衡。

蛋白聚糖基因突變導致的軟骨發(fā)育不全在人類已有報道，在人的外顯子12處插入單個堿基對會引起移碼，造成一種脊柱骨骺發(fā)育不良[7]。這些病癥表明蛋白聚糖的含量對胚胎軟骨的發(fā)育和生長起重要作用。

1.2 連接蛋白：連接蛋白(link protein，LP)結(jié)構(gòu)類似于蛋白聚糖的G1區(qū)域，具有A、B1和B2域，是蛋白聚糖家族成員。其中A1和G1相互作用，B2 則與HA相互作用[10]。完整的人類軟骨連接蛋白以兩種分子形式存在（LP1、LP2），區(qū)別在于其氨基末端分別有2個或1個N-連接寡糖鏈。

哺乳動物有4個連接蛋白基因，其中有一個主要在軟骨內(nèi)表達，每個LP基因都與一個透明質(zhì)酸基因相鄰，但它并不與臨近的必需基因共表達，因為軟骨的LP基因和蛋白聚糖基因不相毗鄰。軟骨的LP在aggrecan中有多種功能：①與蛋白聚糖的HA和G1域相互作用來維持蛋白聚糖的穩(wěn)定性，預防蛋白聚糖的降解；②參與一種“遲緩聚合”現(xiàn)象，因新近分泌的蛋白聚糖不和HA發(fā)生作用，而是通過其G1區(qū)的由LP介導的一種構(gòu)象變化來促進聚集體的形成；③LP和G1域共同形成一種蛋白質(zhì)外殼，覆蓋于HA表面保護HA免受透明質(zhì)酸酶和自由基作用而發(fā)生降解。

1.3 HA：HA是一種以較大的長度及獨特的合成模式為特征的未硫酸化的GAG，通過透明質(zhì)酸合酶(HAS)而分布于細胞膜上[8]，哺乳動物有三種HAS（HAS1、HAS2、HAS3），各自位于染色體的不同部位。HA由于它獨特的合成物模式而被擠出細胞核，作為外殼分布于軟骨細胞周邊，而蛋白聚糖最初可能也位于此處，至于蛋白聚糖聚合物是如何從此處被釋放并移至胞外基質(zhì)目前尚不清楚。軟骨中HA隨著年齡的增長其體積逐漸減小而含量逐漸增多[8]。

HAS1、HAS2、HAS3都在軟骨內(nèi)表達，有研究顯示人軟骨細胞在生長因子和細胞活素的作用下呈現(xiàn)不同的表達規(guī)律，其中HAS2表達水平最高，HAS3表達水平最低。最近對軟骨HAS2 敲除小鼠的研究表明：軟骨HAS2基因的缺失表達會導致嚴重的骨骼異常及圍產(chǎn)期死亡[9]，這揭示了HA和aggrecan在維持正常軟骨功能及軟骨分化和軟骨內(nèi)骨化中的重要作用，也表明了在軟骨HAS1或HAS3的表達不能夠補償HAS2的缺乏。

1.4 SLRPs：SLRPs屬于富含亮氨酸的蛋白質(zhì)大家族，依據(jù)基因的組構(gòu)、亮氨酸重復序列的數(shù)量及GAG鏈結(jié)構(gòu)的類型而分為多個子家族 ，如核心蛋白聚糖、二聚糖、纖維調(diào)節(jié)素及具有10個亮氨酸重復序列的光蛋白聚糖。已有研究報道核心蛋白聚糖和纖維調(diào)節(jié)素在體外被MMPs 降解，而該降解在體內(nèi)也可能發(fā)生[8]。纖維調(diào)節(jié)素和光蛋白聚糖作用于膠原分子的相同區(qū)域，該區(qū)域與核心蛋白聚糖的作用位點不同，核心蛋白聚糖的作用涉及亮氨酸重復序列中的氨基酸序列。GAG鏈和多種生長因子相互作用使SLERPs在細胞外基質(zhì)中為生長因子提供場所。該研究還顯示SLRPs通過調(diào)節(jié)細胞中的生長因子來調(diào)節(jié)軟骨細胞的代謝[9]。SLRPs的合成水平隨年齡而變化，其含量隨年齡變化的確切機制尚不明確，但其產(chǎn)物的缺失能影響組織特性這一點是毋庸置疑的。核心蛋白聚糖的缺乏會導致鄰近纖維組織的融合，膠原纖維的形態(tài)不規(guī)則；二聚糖缺乏會導致類骨質(zhì)疏松癥表型，動物生長率下降和骨量減少。該研究明確表明SLRPs不足會引起組織中膠原纖維結(jié)構(gòu)的破壞，且每種蛋白聚糖都有其特異性的異常表型[9]。

2蛋白聚糖與骨關(guān)節(jié)病

2.1 大骨節(jié)病(KBD)：KBD主要病理改變是四肢透明軟骨的變性壞死，其蛋白聚糖代謝存在明顯異常。研究發(fā)現(xiàn)KBD病區(qū)水中的致病因子促使猴軟骨GAG分子低硫酸化，這種代謝異常與KBD軟骨組織的病理形態(tài)學改變密切相關(guān)。顏煒群等[10]觀察了KBD患者血清對培養(yǎng)軟骨細胞PG代謝的影響，實驗結(jié)果表明KBD患者血清中存在干擾PG代謝的因子，可致PG合成能力明顯下降，分解代謝增加，以致軟骨中PG含量減少，在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出低硫酸化、低分子量和缺乏HA結(jié)合區(qū)，不能與HA結(jié)合形成aggrecan。這些研究結(jié)果提示aggrecan的分子損害是KBD的一個非常重要的特征[10]。

2.2 骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis ，OA)：OA 時PG結(jié)構(gòu)組成和分布發(fā)生明顯變化[11]，首先PG聚合程度明顯降低，aggrecan比例減少，其完整性遭到破壞，可分解為不同大小的片斷。GAG變化表現(xiàn)為KS含量減少，CS含量相對增多；結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，硫酸化程度下降，HA進行性耗竭，預示aggrecan形成能力下降。OA時關(guān)節(jié)各部位的PG變化也不一致，最早、最典型的變化在負重區(qū)，在同一部位則最早變化于軟骨表層，正常時軟骨表層有較多量與表面平行排列的膠原，PG減少和水合增加改變了基質(zhì)的離子組成使膠原松散，并且PG與膠原的交聯(lián)率也減少。膠原結(jié)構(gòu)的破壞使位于其間的PG暴露，易于裂解并引起免疫反應(yīng)。OA時首先發(fā)生PG降解，檢測體液的PG降解產(chǎn)物為早期診斷提供了依據(jù)。PG在細胞粘附、細胞間交流、信息傳遞以及細胞增殖和分化等多方面扮演了重要角色，它的降解在OA發(fā)生、發(fā)展中起到了關(guān)鍵性的作用。

3蛋白聚糖與軟骨移植

軟骨移植的組織來源主要以自體、同種異體和異種軟骨移植物為主。其中，同種異體移植軟骨為僅次于自體軟骨的良好生物材料，其成本低、來源廣泛且生物學性能良好的優(yōu)點，使其目前在臨床上應(yīng)用較多，效果良好，臨床成功率可達90％以上[12]。在正常情況下，蛋白聚糖的合成與分解保持動態(tài)平衡，這種平衡有利于維持軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性[13]。致病因素所導致aggrecan的丟失可以視為軟骨代謝失衡的始動環(huán)節(jié)，如持續(xù)存在，則引起關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維的降解和各種炎性信息因子的釋放，引發(fā)瀑布效應(yīng)，進而徹底打破關(guān)節(jié)軟骨的代謝平衡，使其進入不可逆性的負代謝狀態(tài)，導致細胞外基質(zhì)屏障破壞，最終導致軟骨的吸收。

研究發(fā)現(xiàn)同種異體軟骨移植后軟骨ECM大量衰退，尤其在移植后一個月內(nèi)最為明顯，表現(xiàn)為基質(zhì)中蛋白聚糖含量發(fā)生較大的變化[14]。移植前的軟骨細胞不表達主要組織相容性抗原，移植后一個月左右開始表達，并逐漸增強[15]。最終導致軟骨吸收、降解，影響手術(shù)遠期效果。因此，研究蛋白聚糖在軟骨移植中的降解機制無疑對移

植手術(shù)的術(shù)后效果是很重要的。

4蛋白聚糖與軟骨組織工程

軟骨組織工程是應(yīng)用工程學和生命科學的原理和方法， 將種子細胞與生物載體材料(即支架)復合后進行培養(yǎng)，在體內(nèi)形成具有生理功能的軟骨組織，替代和恢復病變軟骨組織的功能。因此，種子細胞的選擇、培養(yǎng)和軟骨細胞支架材料的研究兩個環(huán)節(jié)在軟骨組織工程中顯得尤為重要。軟骨細胞是常用的種子細胞，隨著培養(yǎng)時間的延長和傳代次數(shù)的增多，軟骨細胞的特異性表型Ⅱ膠原和aggrecan逐漸減少，影響軟骨的形成[16]。因此蛋白聚糖已成為檢測軟骨組織工程的重要指標[16-17]。

5展望

軟骨蛋白聚糖作為軟骨基質(zhì)的關(guān)鍵組成部分，在維持軟骨的生理功能方面發(fā)揮了重要的作用。軟骨移植后的首要變化就是蛋白聚糖的丟失，在KBD、OA等關(guān)節(jié)疾病領(lǐng)域?qū)Φ鞍拙厶堑慕到庖延辛溯^為深入的研究，但尚未見用于軟骨移植研究的報道。因此借鑒骨關(guān)節(jié)疾病中關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)蛋白聚糖代謝的研究方法，進一步探討軟骨代謝改變在軟骨移植后及軟骨組織工程的作用，將對軟骨移植機制的闡明及預防軟骨的丟失和減少排斥反應(yīng)有重要的意義。因此如何維持蛋白聚糖的穩(wěn)定性，從而保持細胞外基質(zhì)的免疫屏障作用，減少異體軟骨的排斥反應(yīng)及吸收，將是我們進一步研究的內(nèi)容。

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[收稿日期]2007-08-10 [修回日期]2007-10-24

編輯/李陽利