姜黃素對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響

[摘要]目的：觀察姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的作用，以尋找治療人瘢痕疙瘩的有效藥物。方法：體外培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，分別應(yīng)用MTT比色法和羥脯氨酸比色法檢測(cè)姜黃素作用后細(xì)胞增殖及膠原合成的變化。結(jié)果：和對(duì)照組相比，姜黃素能夠顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成（P＜0.01）。結(jié)論：姜黃素具有體外抗瘢痕疙瘩的作用，可能成為治療瘢痕疙瘩的有效藥物。

[關(guān)鍵詞]姜黃素；瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；增殖；膠原合成

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2007）11-1543-02

Effect of curcumin on the proliferation of fibroblast and synthesis of collagen in keloid

HU Xiao-long，HU Da-hai，GUAN Hao，YANG Chong-zhi，HAN Yong-bin，JI Peng

（Department of Burn Surgery， Xijing Hospital， the Fourth Military University，Xi＇an710032，Shaanxi，China）

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of curcumin on the proliferation and collagen synthesis of the cultured keloid fibroblasts in vitro and seek the effective drug for human keloid.MethodsThe human keloid fibroblasts were cultured in vitro. The MTT test and hydroxyproline chromatometry were used to detect the effects of curcumin on the proliferation and collagen synthesis of the cultured keloid fibroblasts. ResultsWhen compared with the control groups， curcumin can markedly inhibit the proliferation and collagen synthesis of the cultured keloid fibroblasts（P＜0.01）. ConclusionCurcumin has anti-keloid effects in vitro and may be an effective drug for human keloid.

Key words: curcumin; keloid; fibroblast; proliferation; collagen synthesis

瘢痕疙瘩是結(jié)締組織過(guò)度增生和透明變性引起的良性皮膚腫瘤。瘢痕疙瘩罕見(jiàn)自然消退，其防治尚無(wú)有效方法。成纖維細(xì)胞是瘢痕形成的效應(yīng)細(xì)胞，是研究的重點(diǎn)。姜黃素（curcumin）是從中藥姜黃中提取的一種酚類色素，研究表明姜黃素具有廣泛藥理作用，如抗氧化、抗腫瘤、抗缺血、降血脂等。已有研究表明姜黃素具有抗肝、腎纖維化的作用[1-2]，但是其對(duì)瘢痕疙瘩作用方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts， KFB）為研究對(duì)象，探討姜黃素對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的影響。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：姜黃素與MTT顯色劑（Sigma公司，美國(guó)），二甲基亞砜（Amresco公司，美國(guó)），DMEM（Gibco公司，美國(guó)），小牛血清(杭州四季青)，羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所），DU800型分光光度計(jì)（Beckman Coulter，美國(guó)），IX71型倒置式顯微鏡（Olympus，日本），680型酶標(biāo)儀（Bio-Rad，日本）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組：瘢痕疙瘩的診斷參照1992年Darzi標(biāo)準(zhǔn)。入選標(biāo)準(zhǔn)還包括，2年內(nèi)未接受藥物注射、放療或外科治療，l個(gè)月內(nèi)未予任何外用藥治療，無(wú)系統(tǒng)疾病者。標(biāo)本均來(lái)源于我科瘢痕疙瘩患者手術(shù)標(biāo)本（經(jīng)患者知情同意），選取年輕患者、病程短且生長(zhǎng)活躍的瘢痕疙瘩組織用于細(xì)胞培養(yǎng)。共收集5份標(biāo)本，男3例，女2例；年齡16～36歲，平均(24±5.3)歲；病程1～4年。原代培養(yǎng)采用組織塊貼壁法[3]進(jìn)行，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，常規(guī)消化、傳代。本實(shí)驗(yàn)取第3～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

姜黃素不溶于水，易溶于二甲基亞砜溶液中，將配好的姜黃素二甲基亞砜溶液（濃度為4mmol/L）以5％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整至所需濃度。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，40μmol/L姜黃素所含二甲基亞砜的量未使KFB的生長(zhǎng)受到抑制。實(shí)驗(yàn)分4組：第1組：空白對(duì)照組；第2組：姜黃素5μmol/L組；第3組：姜黃素10μmol/L組；第4組：姜黃素20μmol/L組。

1.3細(xì)胞增殖的測(cè)定：采用MTT法測(cè)定。調(diào)整消化所得細(xì)胞濃度為2×104/ml，每孔100μl接種于96孔板中，過(guò)夜后棄上清，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)24h，細(xì)胞達(dá)70%-80%融合時(shí)，棄上清，再分別加入終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L姜黃素培養(yǎng)基200μl為實(shí)驗(yàn)組，加入含有等量溶劑的5％小牛血清DMEM培養(yǎng)基200μl為對(duì)照組，每組重復(fù)6孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后加入MTT 20μl，37℃，5%CO2孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄上清，每孔加入150μl 二甲基亞砜，振蕩10min，酶標(biāo)儀于570nm測(cè)吸光度(A)值。

1.4細(xì)胞上清液中膠原含量的測(cè)定：采用羥脯氨酸比色法。將KFB以5×104/ml密度接種于24孔板，每孔1ml，置5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，棄10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以無(wú)血清DMEM同步化24h，棄去各孔培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L姜黃素培養(yǎng)基，對(duì)照組加含有等量溶劑的5％小牛血清DMEM培養(yǎng)基，每孔1ml。培養(yǎng)48h后吸取上清液，嚴(yán)格按照羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明測(cè)定各管吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖：應(yīng)用MTT比色法測(cè)定KFB增殖活力，結(jié)果見(jiàn)表1。姜黃素在各實(shí)驗(yàn)濃度作用KFB 48h后，均有明顯抑制作用，且具有濃度依賴性，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 細(xì)胞膠原合成：應(yīng)用羥脯氨酸比色法檢測(cè)KFB上清液中膠原的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。姜黃素在各實(shí)驗(yàn)濃度作用KFB 48h后，上清液中膠原含量明顯降低，且具有濃度依賴性，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3討論

創(chuàng)傷愈合是人體組織修復(fù)的過(guò)程，而瘢痕超常形成是過(guò)度愈合或愈合紊亂的結(jié)果，成纖維細(xì)胞大量增殖和膠原蛋白過(guò)度合成是形成瘢痕疙瘩的主要原因。研究表明，任何非手術(shù)治療瘢痕有效的方法，均應(yīng)直接或間接針對(duì)抑制成纖維細(xì)胞增殖和調(diào)整膠原代謝異常這一重要環(huán)節(jié)。

姜黃素是從姜科姜黃屬多年生的草本植物姜黃中提取的天然色素，為姜黃的主要活性成分。大量研究證明，姜黃素具抗氧化、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、調(diào)節(jié)血管生成、抗腫瘤等多方面藥理作用[4]。近年來(lái)研究表明姜黃素具抗纖維化作用。李銀生等[5]研究表明姜黃素可抑制肺纖維化大鼠肺組織的膠原沉積，在延緩肺纖維化形成中起重要作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。劉劍毅等[6]研究表明姜黃素能夠顯著抑制體外人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成。本研究探討姜黃素對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖過(guò)程有明顯抑制作用，且細(xì)胞抑制情況與姜黃素濃度變化呈量效關(guān)系。而且姜黃素作用后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成也相應(yīng)降低。因此顯示具有體外抗瘢痕疙瘩的效應(yīng)，但用姜黃素治療瘢痕疙瘩尚未見(jiàn)報(bào)道，其作用的具體機(jī)制與途徑尚需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

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[6]劉劍毅， 李世榮， 姚恒，等.姜黃素體外抗人增生性瘢痕纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)， 2006，15(10): 1110-1111.

[收稿日期]2007-07-26[修回日期]2007-10-30

編輯/張惠娟