聯(lián)合培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響

[摘要]目的：觀察體外聯(lián)合培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞形態(tài)和增殖的影響，為研究成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生物學(xué)特性和相互關(guān)系以及體外構(gòu)建含此兩種細(xì)胞的組織工程皮膚提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。 方法：在體外分別分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞并常規(guī)傳代培養(yǎng)。模擬組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)及成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞間的相互影響途徑，按照不同比例（平滑肌細(xì)胞:成纖維細(xì)胞=1:1，1:2，1:3）建立以膠原凝膠為基質(zhì)的成纖維細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)模型。應(yīng)用熒光標(biāo)記、組織學(xué)觀察和MTT法對平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和代謝進(jìn)行研究。 結(jié)果：聯(lián)合培養(yǎng)模型法可以有效地建立起成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的相互影響模式。1:1組的成纖維細(xì)胞對聯(lián)合培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，1:3組的促增殖作用則不明顯。 結(jié)論：1:1聯(lián)合培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，對它們體外培養(yǎng)和擴(kuò)增以及相互關(guān)系的研究對闡明這兩種細(xì)胞組合作為真皮替代物種子細(xì)胞具有重要的意義。

[關(guān)鍵詞]成纖維細(xì)胞；平滑肌細(xì)胞；聯(lián)合培養(yǎng)；組織工程；膠原

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2007）11-1535-03

Effect of fibroblasts in co-culture model on smooth muscle cell proliferation and morphology

FENG Ya-qin 1，2，3，HUANG Sha2，YU Chun-yan1，WANG Hai-lun1，2，F(xiàn)ENG Feng1，2，ZOU Yun-dong2，NIU Jie3，JIN Yan2

(1.Department of Dermatology，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710038，Shaanxi，China； 2.Center for Tissue Engineering，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China； 3.Weinan Convalescent Hospital of Shaanxi Military Area Command of PLA，Weinan 714000，Shaanxi，China)

Abstract： ObjectiveTo observe the effects of fibroblasts (Fb) in vitro co-culture on morphology and proliferation of smooth muscle cells (SMC)， and bio-characteristics as well as interrelation between them. To provide theoretical and practical foundation for constructing tissue engineering skin contained Fb and SMC.MethodsFb and SMC were cu1tured in vitro by dissociation and explanation of tissue individually，then implanted according different ratios（SMC : Fb=1:1，1:2，1:3）in collagen to establish co-culture model， mimicking the structure of tissue engineering skin and interaction between Fb and SMC. Morphology and metabolism of SMC was evaluated in terms of fluorescence-labeling， histological observation and MTT. ResultsCo-culture model is an effective method to establish the interaction between Fb and SMC; Fb exhibits the proliferating effects on SMC in 1:1 model of co-culture， while the effects weaken in 1:3 model. ConclusionFb plays the positive role in co-culture model (1:1) on morphology and proliferation of SMC， and the study on interaction between Fb and SMC is very important for constructing tissue engineering skin contained Fb and SMC.

Key words: fibroblasts; smooth muscle cells; co-culture; tissue engineering; collagen

真皮為皮膚提供機(jī)械保護(hù)和必要的營養(yǎng)并決定它的外觀特征，因此真皮替代物的研制是皮膚組織工程研究中的重點(diǎn)所在。近年來，用成纖維細(xì)胞與膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分混合進(jìn)行的三維培養(yǎng)，已成為制備組織工程皮膚的真皮替代物的主要方法[1]。在這樣的三維培養(yǎng)中，成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分形成真皮替代物，再和表皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)后形成組織工程皮膚，植入機(jī)體后經(jīng)過數(shù)月甚至更長時(shí)間后才逐漸產(chǎn)生彈性纖維，因此，植入的組織工程皮膚在很長時(shí)間內(nèi)會(huì)缺乏彈性[2]。本研究試圖在模擬組織工程皮膚結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用平滑肌細(xì)胞更利于彈性纖維產(chǎn)生的優(yōu)勢，按照不同比例建立以膠原凝膠為基質(zhì)的成纖維細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)模型，研究成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞間的相互關(guān)系和生物學(xué)行為，為這兩種細(xì)胞的組合作為真皮替代物種子細(xì)胞的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1 主要試劑：磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，胰蛋白酶，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)，胎牛血清(FBS)，M199培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，谷氨酰胺，成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等均為美國Gibco公司產(chǎn)品；膠原為Sigma公司生產(chǎn)；二甲基亞砜(MSOF)，四甲基噻唑二苯基四溴鹽 (MTT)，四季青公司生產(chǎn)；CX40普通光學(xué)顯微鏡和CK40倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和體外擴(kuò)增：取健康雄性小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，在無菌條件下迅速開胸取出心肺，分離肺動(dòng)脈，將中膜剪成0.1～0.3mm2大小組織塊，貼壁于培養(yǎng)瓶中置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度接近融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA消化傳代，取第5代或6代的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和體外擴(kuò)增：取小鼠剩余皮片，盡可能徹底地修除表皮和皮下脂肪，將真皮剪成0.5～1.0mm2的組織塊，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，消化下來的細(xì)胞置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，再加入含150ml／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次。原代培養(yǎng)細(xì)胞基本長滿瓶壁后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第5代或6代的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：取第5代細(xì)胞在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)及貼壁時(shí)間，并攝片記錄。

1.5 MTT法測定細(xì)胞活性：取第5代平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別以1:1、1:2、1:3（細(xì)胞數(shù)量為4000／孔）的比例接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200μl培養(yǎng)液于37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下培養(yǎng)。每天同一時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取5孔細(xì)胞，加入5％MTT 20μl/孔，培養(yǎng)4～6h，吸出液體，每孔加150μl二甲基亞砜振蕩10min，酶聯(lián)免疫測定儀測定波長490nm處的吸光度。取5孔吸光度的均值，以時(shí)間(天)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪圖。

1.6 以膠原凝膠為基質(zhì)的聯(lián)合培養(yǎng)模型的構(gòu)建：①1:1組：取生長狀態(tài)良好的平滑肌細(xì)胞用Hoechst 33342標(biāo)記，將其與真皮成纖維細(xì)胞按1:1比例各以1.5×106／ml的密度與3mlI型膠原(膠原濃度8mg／ml，混合前加入10%的10×DMEM 和胎牛血清，充分混勻，調(diào)節(jié)pH到7.4)混合，37℃孵育凝固后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)5天獲得組織工程真皮即平滑肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)模型；用HE染色和熒光顯微鏡觀察構(gòu)建的模型中平滑肌細(xì)胞的形態(tài)和分布；②1:2組和1:3組以不同數(shù)量的成纖維細(xì)胞代替，其余處理及檢測同1:1組。

2結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察：光鏡下觀察，第5代培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞呈細(xì)長梭形(圖1)，成纖維細(xì)胞呈細(xì)長形、扁平星狀結(jié)構(gòu)(圖2)，均處于功能活躍狀態(tài)。

2.2 MTT法測定細(xì)胞代謝活性：MTT檢測結(jié)果顯示（圖3），平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在1:1的比例時(shí)，平滑肌細(xì)胞的增殖較快，代謝較為活躍（P＜0.05）；在成纖維細(xì)胞比例增加時(shí)（SMC : Fb=1:2、1:3），平滑肌細(xì)胞的活性一般，增殖作用不明顯（P＞0.05）。

2.3共培養(yǎng)模型的大體觀察：大體觀察含兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)模型（圖4），所見結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)的組織工程真皮在色澤、質(zhì)地等方面未見明顯差別[3]，然而由于所用平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞比例不同，含較高比例的平滑肌細(xì)胞的皮膚模型（1:1）的外觀明顯好于含平滑肌細(xì)胞比例較低 (1:2、1:3) 的皮膚模型，尤其是1:3組模型的邊緣收縮較為明顯。

2.4共培養(yǎng)模型的組織學(xué)觀察：HE染色結(jié)果顯示，1:1組的細(xì)胞明顯較其它組多，細(xì)胞密度較大。梭形細(xì)胞體積較大，核大、淡染，核仁明顯，表明此時(shí)細(xì)胞的合成功能很活躍。而1:3組的細(xì)胞體積較小，核深染、核仁不明顯，胞質(zhì)少，各組合成的共培養(yǎng)模型都具有真皮替代物的結(jié)構(gòu)(圖5)。

本實(shí)驗(yàn)采用Hoechst 33342標(biāo)記平滑肌細(xì)胞的方法對共培養(yǎng)模型中成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞的影響進(jìn)行了分析。熒光顯微鏡下各組模型所形成的真皮層均能觀察到標(biāo)記為藍(lán)色熒光的平滑肌細(xì)胞分布（圖6）。

3討論

隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和組織工程學(xué)的興起，皮膚組織的體外重建正由設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。近年來，國內(nèi)外已有不少學(xué)者將體外培養(yǎng)的皮膚替代物移植應(yīng)用于臨床修復(fù)創(chuàng)傷皮膚缺損創(chuàng)面[4-5]。由成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建的真皮替代物具有較強(qiáng)的生物活性，不引起免疫排斥反應(yīng)，而且可促進(jìn)表皮細(xì)胞生長及表皮真皮連接形成，改善移植物的物理性能和美觀效果。然而這樣構(gòu)建的真皮替代物植入機(jī)體后，往往需要在數(shù)月至2年后才逐漸產(chǎn)生彈性纖維。已有文獻(xiàn)證實(shí)平滑肌細(xì)胞與膠原等多糖基質(zhì)混合培養(yǎng)后可產(chǎn)生彈性纖維[6]。因此，我們考慮將平滑肌細(xì)胞也作為種子細(xì)胞引入真皮替代物的構(gòu)建，進(jìn)一步改善皮膚替代物的功能性。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者將重點(diǎn)放在觀察體外聯(lián)合培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞形態(tài)和增殖的影響上，以此證實(shí)這兩種細(xì)胞的相互關(guān)系和共同作為種子細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程皮膚的可行性和潛能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以膠原凝膠為基質(zhì)建立的聯(lián)合培養(yǎng)模型法，可有效評估成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞的影響。1:1組的成纖維細(xì)胞對聯(lián)合培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞有明顯促增殖作用，1:3組的成纖維細(xì)胞比例過高，促增殖作用反而不明顯。顯微鏡觀察可見，平滑肌細(xì)胞在1:1聯(lián)合培養(yǎng)組所構(gòu)建的真皮替代物中分布均勻，細(xì)胞體積與胞核均較大，提示該細(xì)胞的合成功能活躍，這可能與成纖維細(xì)胞分泌的各種生長因子的作用有關(guān)。但成纖維細(xì)胞比例的增加，對平滑肌細(xì)胞的增殖作用反而會(huì)減弱，因此探討合適的培養(yǎng)比例對它們聯(lián)合培養(yǎng)和擴(kuò)增以及相互關(guān)系的研究具有重要的意義。綜上所述，通過觀察聯(lián)合培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響，筆者認(rèn)為用1:1聯(lián)合培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞對平滑肌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，這兩種細(xì)胞的組合有望共同作為種子細(xì)胞構(gòu)建一種新的真皮替代物。

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[收稿日期]2007-06-21[修回日期]2007-10-21

編輯/張惠娟