殼聚糖固定化脲酶生物傳感器選擇性測(cè)定銅離子

曾憲冬，柳 潔，張資平，孔 舒

（1.深圳市南山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳518054）

（2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005）

0 引言

銅離子是一種重要的環(huán)境污染物，超過(guò)一定的濃度就會(huì)對(duì)環(huán)境和人體造成危害。檢測(cè)環(huán)境、生物及其它實(shí)際樣品中的銅離子是非常重要的[1～3]。目前用于測(cè)定銅離子的通用方法有原子吸收光譜法（AAS）[4～6]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[7]等。這些方法存在儀器昂貴、運(yùn)行費(fèi)用高、不易攜帶等缺點(diǎn)，在連續(xù)監(jiān)測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等方面受到很大限制。生物傳感器作為一種新的檢測(cè)手段，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、成本低廉、能在復(fù)雜的體系中快速檢測(cè)等特點(diǎn)。由于重金屬離子對(duì)許多酶的活性具有抑制作用，因此，構(gòu)建用于檢測(cè)重金屬離子的酶抑制型生物傳感器引起了廣泛研究關(guān)注[8～10]。酶抑制型生物傳感器常用的酶包括脲酶、過(guò)氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、葡萄糖氧化酶和乙酰膽堿脂酶等。其中脲酶由于廉價(jià)易得，故而使用最廣泛。但是酶的活性往往可以受到多種重金屬離子的抑制，因此如何改善酶抑制型生物傳感器的選擇性，實(shí)現(xiàn)特定重金屬離子的檢測(cè)，成為這一研究領(lǐng)域的重要課題。

殼聚糖（CS）是一種線性的親水性多聚糖，一般通過(guò)天然的甲殼素脫乙酰獲得。由于其具有很好的生物相容性和極好的成膜特性，廣泛用于酶生物傳感器的構(gòu)建[11～13]。同時(shí)，殼聚糖對(duì)于重金屬離子具有吸附富集作用[14]，用殼聚糖作為固定載體，有利于提高重金屬離子檢測(cè)的靈敏度。該研究工作利用殼聚糖將脲酶固定于pH 電極表面，構(gòu)建了用于Cu2+檢測(cè)的傳感器，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了Cu2+的選擇性檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

PXJ-1B型數(shù)字式離子計(jì) （江蘇電分析儀器廠），E-901型pH 平面復(fù)合電極 （上海羅素科技有限公司），X-7 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）。

殼聚糖（脫乙酰度＞75%）、洋刀豆脲酶（EC 3.5.1.5，50～100 unit/mg）購(gòu)自Sigma 公司，重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）購(gòu)自中國(guó)計(jì)量研究院，使用時(shí)，用0.05 mol/L pH6.0 的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋至一定濃度作為酶抑制劑。尿素（＞99.5%）購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司，將其溶解于0.05 mol/L pH6.0 的PBS 中配成5 mmol/L 的溶液做為酶促反應(yīng)的底液。其余試劑均為分析純。

1.2 生物傳感器的構(gòu)建

殼聚糖用1%（V/V）醋酸溶解，攪拌大約4 h，使殼聚糖固體完全溶解然后過(guò)濾除去可能存在的不溶性雜質(zhì)，所配殼聚糖溶液濃度為2%（W/V）。稱取適量的脲酶，加入到pH6.0 的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，配制成10%的脲酶溶液。為獲得好的響應(yīng)性能，對(duì)脲酶溶液與殼聚糖溶液的比例進(jìn)行了優(yōu)化，最優(yōu)條件為1 體積的脲酶溶液與5 體積的殼聚糖溶液進(jìn)行混合。然后用微量注射器取10 μL 混合液滴于處理好的pH 電極表面，再用一個(gè)燒杯蓋在電極上面，使溶劑緩慢揮發(fā)以得到均勻的膜層。制備好的生物傳感器在使用前，先浸泡在pH6.0 的PBS 中1 h 后用純水沖洗，以便酶修飾層溶脹和除去殘留的醋酸。

1.3 Cu2+的檢測(cè)

首先將制備好的生物傳感器置于尿素溶液中，測(cè)定經(jīng)過(guò)一定時(shí)間酶促反應(yīng)引起的電位變化ΔE，然后用緩沖溶液沖洗電極，使其電位回復(fù)至初始電位。將生物傳感器浸入含Cu2+的溶液一段時(shí)間，使酶的活性受到抑制，再將其置于尿素溶液中，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間酶促反應(yīng)引起的電位變化為ΔE′。通過(guò)抑制前后電位變化的差異可以計(jì)算出Cu2+對(duì)脲酶活性的抑制率，計(jì)算公式為：

根據(jù)不同濃度Cu2+下抑制率的變化，可獲得抑制率與重金屬離子濃度間的響應(yīng)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物傳感器的電位響應(yīng)

將制備好的脲酶生物傳感器置于尿素溶液中，pH 電極的電位響應(yīng)如圖1中a所示，由于固定于pH 電極表面的脲酶催化作用，尿素溶液發(fā)生水解，引起pH 電極的電位發(fā)生變化。而將脲酶生物傳感器先浸入含Cu2+的溶液一段時(shí)間后，再將其置于尿素溶液中，電位響應(yīng)如圖1中b所示，可以看到，電位變化的趨勢(shì)與a 相似，但是電位變化值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于前者，這一現(xiàn)象說(shuō)明，Cu2+能明顯抑制脲酶的活性。

2.2 生物傳感器測(cè)定條件的優(yōu)化

2.2.1 酶促反應(yīng)時(shí)間的選擇

從圖1中可以看出，在開(kāi)始的5 min 里，隨著尿素的酶催化水解反應(yīng)發(fā)生，生物傳感器的電位響應(yīng)逐漸增大，5 min 后，由于水解反應(yīng)接近平衡，電位響應(yīng)也趨于穩(wěn)定，因此，酶促反應(yīng)的時(shí)間選定為5 min。

2.2.2 抑制時(shí)間的影響

酶與Cu2+溶液的接觸時(shí)間會(huì)影響到其對(duì)酶活性的抑制效果。不同抑制時(shí)間下，脲酶活性的抑制率如圖2所示，從圖中可以看出，在30 min 以內(nèi)隨著抑制時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸增大；30 min 后，抑制率不再發(fā)生明顯變化。這是由于在30 min 后，Cu2+與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合達(dá)到了平衡，因而其對(duì)酶活性的抑制率也不在發(fā)生變化，因此，在該試驗(yàn)中，酶抑制的時(shí)間選定為30 min。

圖1 生物傳感器在5 mmol/L 的尿素溶液中電位響應(yīng)：（a）酶未被抑制，（b）酶被0.2 μg/mL Cu2+抑制30 min 后Fig.1 The potential response curve of the biosensor in 5 mmol/L urea solution:(a)the activity of urease was not inhibited,(b)the activity of urease was inhibited by 0.2 μg/mL Cu2+for 30 min

圖2 抑制時(shí)間對(duì)酶活性抑制率的影響Fig.2 Dependence of inhibition rate(I)on inhibition time

2.2.3 生物傳感器選擇性的改善

除了Cu2+以外，其他重金屬離子，尤其是Hg2+與Ag+，對(duì)于脲酶的活性也具有很強(qiáng)的抑制作用，因此這些離子對(duì)Cu2+的測(cè)定具有交叉干擾。在上述測(cè)定條件下1 μg/mL 濃度的Cu2+、Hg2+、Ag+對(duì)脲酶的抑制率分別為96.43%、98.54%和100%，三種離子對(duì)脲酶的抑制影響較為相似。為了消除干擾，選擇性檢測(cè)Cu2+，必須對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高該生物傳感器選擇性。在溶液中添加某種陰離子，與Hg2+及Ag+生成難溶鹽，是降低它們對(duì)脲酶活性的影響的一種有效途徑。通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較，確定NaI 作為一種有效的添加劑來(lái)消除Hg2+和Ag+的影響，加入濃度為5 mmol/L NaI 后，Hg2+和Ag+濃度在1 μg/mL 以內(nèi)均對(duì)脲酶的活性沒(méi)有影響（抑制率＜10%）。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入的NaI 對(duì)于Cu2+的檢測(cè)靈敏度沒(méi)有明顯的影響。

2.3 生物傳感器對(duì)Cu2+的檢測(cè)性能

2.3.1 線性范圍及檢出限

在最優(yōu)檢測(cè)條件下，不同濃度的Cu2+對(duì)脲酶活性的抑制率如圖3所示，從圖中可以看出，脲酶活性的抑制率隨著Cu2+濃度的增加逐漸增加，在0.005～0.5 μg/mL 的Cu2+濃度范圍內(nèi)，脲酶活性的抑制率與Cu2+濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線性響應(yīng)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9。以脲酶受到明顯抑制，及抑制率＞10%計(jì)，該生物傳感器對(duì)Cu2+的檢出限為0.002 μg/mL。當(dāng)Cu2+濃度大于1 μg/mL時(shí)，脲酶的活性幾乎完全被抑制（抑制率＞95%）。

2.3.2 生物傳感器的再生及其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性

為了考察所制備的生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，首先要對(duì)生物傳感器的再生進(jìn)行研究。EDTA 是一種高效的Cu2+螯合劑，因此，可以利用EDTA 來(lái)去除與酶活性中心結(jié)合的Cu2+使酶的活性得到恢復(fù)，從而使生物傳感器得到再生。實(shí)驗(yàn)研究表明，EDTA 濃度0.5 mmol/L，再生時(shí)間5 min，生物傳感器可以獲得最佳再生效果，酶活性可以恢復(fù)至初始狀態(tài)的95%。

在上述再生條件，用同一生物傳感器重復(fù)測(cè)定0.5 μg/mL 的Cu2+溶液8次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%，這一結(jié)果說(shuō)明該生物傳感器具有很好的精密度。

將新制備的生物傳感器浸泡在4℃，pH6.0的PBS溶液中，通過(guò)每天測(cè)定其對(duì)同一濃度Cu2+溶液的響應(yīng)考察了該生物傳感器的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該生物傳感器表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，在30 d 內(nèi)靈敏度沒(méi)有明顯下降。

圖3 生物傳感器對(duì)Cu2+檢測(cè)的校正曲線Fig.3 Calibration curve for Cu2+determination by the proposed biosensor

2.3.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

為了進(jìn)一步考察該生物傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，采集了兩份工業(yè)廢水樣品，同時(shí)用所制備的生物傳感器及ICP-MS 進(jìn)行分析對(duì)比，兩種方法對(duì)兩份水樣中Cu2+濃度測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差分別為5.1%和4.2%，兩種方法的測(cè)定值具有很好的一致性，從而證明該生物傳感器能用于實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)。

3 結(jié)論

以殼聚糖作為載體，將脲酶固定于pH 電極表面，成功制備出可靈敏檢測(cè)Cu2+的生物傳感器。在樣品溶液中加入NaI，可以消除Hg2+和Ag+對(duì)Cu2+測(cè)定的干擾。同時(shí)，該生物傳感器具有良好的再生能力，能重復(fù)利用，且重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高，能用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

[1]Chan Y H,Chen J X,Liu Q S,et al.Ultrasensitive Copper(Ⅱ) Detection Using Plasmon-Enhanced and Photo-Brightened Luminescence of CdSe Quantum Dots[J].Anal.Chem.,2010,82(9):3 671～3 678.

[2]Brown DR,Kozlowski H.Biological inorganic and bioinorganic chemistry of neurodegeneration based on prion and Alzheimer diseases[J].Dalton.Trans.,2004,13:1 907～1 917.

[3]Xia B,Zhang W,Shi J,et al.Fluorescence quenching in luminescent porous silicon nanoparticles for the detection of intracellular Cu2+[J].Analyst,2013,138 (13):3 629～3 632.

[4]Cassella R J,Magalh?es O I B,Couto M T,et al.Synthesis and application of a functionalized resin for flow injection/F AAS copper determination in waters[J].Talanta,2005,67(1):121～128.

[5]Llobat-Estellés M,Mauri-Aucejo A R,Marin-Saez R.Detection of bias errors in ETAAS:Determination of copper in beer and wine samples[J].Talanta,2006,68(5):1 640～1 647.

[6]Chen X W,Huang L L,He R H.Silk fibroin as a sorbent for on-line extraction and preconcentration of copper with detection by electrothermal atomic absorption spectrometry[J].Talanta,2009,78(1):71～75.

[7]Wu J,Boyle E A.Low Blank Preconcentration Technique for the Determination of Lead,Copper,and Cadmium in Small-Volume Seawater Samples by Isotope Dilution ICPMS[J].Anal.Chem.,1997,69(13):2 464～2 470.

[8]Malitesta C,Guascito M R.Heavy metal determ ination by biosensors based on enzyme immobilised by electropolymerisation[J].Biosens.Bioelectron.,2005,20(8):1 643～1 647.

[9]Tadeusz K,Malgorzata M,Trojanowicz M.Inhibitive determination of mercury and other metal ions by potentiometric urea biosensor[J].Biosens.Bioelectron.,2000,15(11-12):681～691.

[10]Volotovsky V,Nam Y J,Kim N.Urease-based biosensor for mercuric ions determination[J].Sensors and Actuators B,1997,42(3):233～237.

[11]江麗萍,吳霞琴,龔翠萍,等.殼聚糖修飾電極的電化學(xué)行為及其在生物傳感器中的應(yīng)用[J].化學(xué)傳感器,2002,22(4):18～23.

[12]Luo X L,Xu J J,DuY.A glucose biosensor based on chitosan–glucose oxidase–gold nanoparticles biocomposite formed by one-step electrodeposition [J].Anal.Biochem.,2004,334(2):284～289.

[13]Zhang M G,Smith A,Gorski W.Carbon nanotube-chitosan system for electrochemical sensing based on dehydrogenase enzymes[J].Anal.Chem.,2004,74(19):5 045～5 050.

[14]Wu F,Tseng R,Juang R.A review and experimental verification of using chitosan and its derivatives as adsorbents for selected heavy metals[J].Journal of Environmental Management,2010,91(4):798～806.