海藻糖的生產(chǎn)制備及應用前景

馬文錦　劉樹興　潘巨忠　凌建剛

摘要 海藻糖是一種廣泛分布于細菌、真菌和動植物體內(nèi)的雙糖，是由兩個吡喃環(huán)葡萄糖分子以α- 1 ，1 糖苷鍵連接的非還原性二糖。從海藻糖的理化性質(zhì)、海藻糖的長期毒理性實驗、生產(chǎn)制備方法、應用研究概況以及應用前景方面做了詳細的綜述，以期促進這一產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。

關(guān)鍵詞 海藻糖；生產(chǎn)制備；應用前景

海藻糖又稱酵母糖，分子式為C12 H22O11·2H2O，是由兩個吡喃環(huán)葡萄糖分子以α-1，1糖苷鍵連接的非還原性二糖。1832年由Wigger從黑麥中首次分離得到海藻糖，之后研究發(fā)現(xiàn)海藻糖廣泛存在于動植物體和微生物體內(nèi)。因海藻糖對生物活性物質(zhì)具有重要的抗逆保鮮作用，許多生物體在逆境條件下都能通過體內(nèi)調(diào)節(jié)增加海藻糖的含量來抵御外界不良的傷害。此外，海藻糖通過外加式同樣能對生物體和生物大分子起著良好的非特異性保護作用。因此，海藻糖在食品、生物學、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、保健品、化妝品等方面具有廣闊的市場前景。而且它是一種極好的干燥劑和保鮮劑， 同時也是一種新型功能性低聚糖。故在果蔬防腐、保鮮方面又多了一渠道。特別是一些干燥食品在復水后如果添加海藻糖仍能保持其原有形狀、色澤、口味、組織和維生素。海藻糖正是因其獨特的生物學特性而倍受關(guān)注，成為當今國際研究和開發(fā)的熱點[1]。

1海藻糖的理化性質(zhì)

海藻糖的熔點97.0℃，溶解度為68.9g/100g H2O（25℃），它的甜度相當于蔗糖甜度的45%，在RH90%以下，無吸濕性。由于它不具有還原性，因此對熱和酸都具有非常好的穩(wěn)定性。在加熱過程中不易發(fā)生美拉德反應，在pH值為3.5～10.0范圍的溶液中，于100℃保持24h，分解率僅為1%。海藻糖幾乎不能被一般的酶所分解，只有少數(shù)特異性的海藻糖酶才能水解海藻糖。無水結(jié)晶海藻糖具有很強的吸水性，如遇含水物質(zhì)，能有效地吸收該物質(zhì)中的水分子，自身成為含水結(jié)晶海藻糖。因此，無水結(jié)晶海藻糖是一種理想的熱敏性物質(zhì)脫水劑。海藻糖的抗腐蝕性很強，不易生成不溶性的葡聚糖，而且能抑制由砂糖產(chǎn)生的不溶性葡聚糖的附著。因此，海藻糖不易被口腔中引起齲齒的變異鏈球菌所利用[2]。

2海藻糖長期毒理性實驗

梁春華等[3]對80只大鼠進行了食用海藻糖的長期毒性實驗研究，結(jié)果顯示如下：

2.1給藥期海藻糖對各組實驗動物的影響

從給藥期各組動物指標（體重、食量、臟器指數(shù)、血液學及血液生化）顯示，各實驗組與對照組間無顯著差異（p＞0.05），均未見大鼠的外觀體征、行為活動等明顯改變，而且對大鼠的臟器病理組織學檢查結(jié)果也沒有顯示藥物中毒引起的病理學改變，表明連續(xù)90d給藥（低、中、高3個劑量組）海藻糖未引起大白鼠的毒性反應。

2.2恢復期海藻糖對各組動物的影響

恢復期海藻糖對各組動物的影響檢查結(jié)果也未見藥物中毒引起的病理學改變，表明海藻糖毒性非常低，不能引起延遲性中毒反應。從對恢復期（停藥后14d） 各組大鼠的外觀體征、行為活動及解剖后臟器指數(shù)、病理檢查、血液、血相等指標來看，各給藥組及對照組間的大鼠也均未見明顯差異（p＞0.05）。

3海藻糖的生產(chǎn)與制備

雖然海藻糖的來源廣泛，但是能夠大量積累海藻糖的物種很少。而且海藻糖是生物體對抗逆境的一種代謝應激物，如果外部環(huán)境適宜，海藻糖又會迅速降解，給制備帶來一定困難，造成價格一直居高不下，這也成為擴大其應用的最大障礙。因此，研究和開發(fā)海藻糖的制備方法已引起企業(yè)界的普遍關(guān)注和重視，已經(jīng)確定的海藻糖生物合成途徑為海藻糖的生產(chǎn)提供了依據(jù)，目前正在研究和開發(fā)的海藻糖制備方法主要有微生物抽提法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法以及基因重組法。

3.1微生物抽提法

國內(nèi)外對選育高產(chǎn)海藻糖的酵母菌種和提取、純化工藝進行了大量研究，至20世紀40年代，歐美等國從面包酵母中抽提海藻糖取得成功。Comes等分離出2個裂殖酵母菌株，它們在熱擊條件下大量積累海藻糖；李于等對酵母中海藻糖的提取和純化工藝進行了研究，其純度可達98 %以上。微生物抽提法是以乳酸菌、酵母、霉菌及其他一些含海藻糖的菌體為提取源，傳統(tǒng)的海藻糖生產(chǎn)方法如下：首先通過干燥、改變滲透壓等方法處理菌體；然后經(jīng)過乙醇等有機溶劑抽提、精制，從而得到較高純度的海藻糖晶體。由于酵母中海藻糖含量較高，可達細胞干重的20%，通常以酵母提取為主。最早使用的海藻糖提取方法是酵母提取法，其工藝經(jīng)過不斷改進，已相當成熟，至今仍然是生產(chǎn)海藻糖的重要方法。由于從微生物中提取海藻糖成本高，提取源有限，很大程度制約著海藻糖大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

3.2發(fā)酵法

日本首先從發(fā)酵液中提取海藻糖，提取率可達到88.6 %，同時純度達到99.5 %。發(fā)酵法是在一定的基質(zhì)上培養(yǎng)微生物，這些微生物主要包括節(jié)桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、諾卡氏菌屬、絲核菌屬、微球菌屬等。通過這些微生物發(fā)酵來生產(chǎn)海藻糖，再從發(fā)酵液中提取精制而成。一般先通過誘變、細胞融合或基因重組選育產(chǎn)海藻糖高的菌株；然后采用高濃度的培養(yǎng)基及高滲發(fā)酵，并在發(fā)酵結(jié)束前讓菌體“饑餓”2～3h ，從而得到含海藻糖較高的培養(yǎng)物。該方法的缺點是轉(zhuǎn)化率低，發(fā)酵液成分復雜，海藻糖的提取、精制困難，因而對于降低生產(chǎn)成本、促進推廣應用很困難。

3.3酶轉(zhuǎn)化法

酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)海藻糖的方法很多，采用葡萄糖、麥芽糖或淀粉等為底物，通過作用與海藻糖合成有關(guān)的酶的作用轉(zhuǎn)化成海藻糖。根據(jù)其作用底物，可分為以葡萄糖、麥芽糖、淀粉為底物的三種生產(chǎn)方法。

3.3.1以葡萄糖為底物。利用專一性很強的海藻糖-6-磷酸合成酶與海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶共同催化葡萄糖生成海藻糖，而以葡萄糖-6-磷酸作為葡糖基受體，UDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖或ADP-葡萄糖為葡糖基給體，在整個的反映過程中需要消耗高能物質(zhì)UDP、GDP或ADP，所以很難實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

3.3.2以麥芽糖為底物。在某些耐熱菌中發(fā)現(xiàn)一種海藻糖合成酶它能α-1，4-麥芽糖在分子內(nèi)重組成α-1，1-海藻糖。該酶具有較嚴格的底物專一性，只作用于麥芽糖生成海藻糖及從海藻糖生成麥芽糖，海藻糖合成酶催化麥芽糖反應生成海藻糖的收率高，海藻糖合成酶可能有比較弱的水解作用，溫度提高水解作用加強，就會導致產(chǎn)率下降。這種酶反應簡單，底物麥芽糖價格便宜，因而使用耐熱菌可以避免在工業(yè)生產(chǎn)中引起雜菌污染，這是適用于工業(yè)生產(chǎn)中的理想途徑[4]。

3.3.3以淀粉為底物。以淀粉為底物生產(chǎn)海藻糖也有兩條途徑：第一條途徑是利用葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyl transfer GTase）和淀粉酶（amylase）轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖，它的轉(zhuǎn)化率很高，可達到81.5%。這類酶廣泛存在于硫化葉菌科中[5]。它的熱穩(wěn)定性好，淀粉的價格也比較便宜，可望成為工業(yè)生產(chǎn)海藻糖的新途徑。第二條途徑是利用麥芽寡糖基海藻糖合成和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的協(xié)同作用，將直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為海藻糖[6]。這類酶體系的轉(zhuǎn)化率可達80%以上，1995年日本將該方法應用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，使海藻糖的價格大幅度降低。

3.4基因重組法

基因重組法包括兩個方面：一是利用工程微生物和酶工程改進海藻糖生產(chǎn)，其優(yōu)點是提高產(chǎn)量，降低成本；二是利用與合成海藻糖相關(guān)的基因構(gòu)建具有抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。很多微生物能產(chǎn)海藻糖，其生物合成途徑涉及2種酶——海藻糖-6-磷酸連接酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶，基因重組法在微生物中的實驗就是依據(jù)此事實進行的。最近有研究報道，將大腸桿菌中2種與海藻糖合成有關(guān)的酶（海藻糖-6-磷酸合成酶OtsA 和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶OtsB） 的基因異源表達于棒狀桿菌，大大提高了該菌生產(chǎn)海藻糖的能力[7] 。荷蘭的Mogen 和Vander Have 公司已經(jīng)開發(fā)出了提高甜菜和馬鈴薯等作物中海藻糖產(chǎn)量的技術(shù)，并獲得了專利。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，該方法一定會越來越廣泛地應用于工業(yè)生產(chǎn)[8]。

4海藻糖的應用前景

4.1在食品加工工業(yè)中的應用

海藻糖在食品工業(yè)中運用，主要對海藻糖具有的非還原性、保濕性、抗凍結(jié)性和耐高溫性、干燥性、優(yōu)質(zhì)甜味、能量來源等功能與特性考慮，進行多種用途的功能性食品添加劑來開發(fā)研究。過去抑制淀粉老化主要采用添加糖類、酶制劑、乳化劑等方法，但只有添加糖較為有效。海藻糖具有優(yōu)異的防止淀粉老化的作用，其防止淀粉老化率明顯優(yōu)于其他糖類，可以起到防止蛋白質(zhì)變性的功能。研究證明，在含蛋白質(zhì)的各種食品中添加海藻糖，可非常有效地保護蛋白質(zhì)由于一些原因而引起的變性，從而保證了食品的風味和質(zhì)地保持不變。同時，在比較蔗糖、麥芽糖、海藻糖的防止蛋白質(zhì)變性效果實驗中，同樣發(fā)現(xiàn)海藻糖的防止蛋白質(zhì)變性效果最佳。因此，在今后蛋白質(zhì)食品以及各種酶制劑、醫(yī)藥品等領域可以充分應用海藻糖。抑制食品中的異味、臭味在魚類、肉禽類食品加工過程中，尤其是在加熱處理時會產(chǎn)生三甲胺，這就是魚肉類食品令人不快的腥味、異味的主要成分，如在加熱這些食品前添加海藻糖，可降低三甲胺的生成，掩蔽令人不愉快的腥味和臭味。此外，海藻糖還可抑制脂類物質(zhì)氧化酸敗，保持這類食品的風味和質(zhì)量保持不變。對食品的保鮮作用方面的研究發(fā)現(xiàn)，用海藻糖處理新鮮果蔬能起到良好的保鮮效果。如用5 %的海藻糖溶液浸泡處理蘋果，不但能防止其褐變，而且組織也保持良好。海藻糖不僅對蘋果、桃子等新鮮的果蔬起到良好的保鮮作用，對蘿卜、白菜等鹽腌制品同樣起著保鮮作用。此外，運用其保鮮功能處理江浙一帶的果蔬如楊梅、葡萄、茭白等，相信產(chǎn)生的經(jīng)濟效益將非?？捎^?，F(xiàn)已有實驗證明，海藻糖不被齲齒菌所利用，可以作為保護牙齒食品的甜味劑，今后可作為非齲齒的糖類甜味劑而用于食品和飲料，從而大大改善食品的質(zhì)量并增加食品的花色品種，促進食品工業(yè)的進一步發(fā)展。

4.2在醫(yī)藥工業(yè)的應用

海藻糖在醫(yī)藥上用途也很廣泛，可用于保存各種疫苗、抗體、酶、病毒等生物活性物質(zhì)。由于經(jīng)過海藻糖處理的藥品無需冷凍保藏，可節(jié)省巨額的冷凍保藏費用。此外，海藻糖還可作為各種藥物的甜味劑，如：口服液、片劑、丸劑、漱口劑等。

4.3海藻糖在生物制品中的應用與發(fā)展

抗血清抗體在海藻糖存在時，37℃下空氣干燥后于室溫下貯存3d，生物活性不發(fā)生明顯變化。在對DNA 限制性內(nèi)切酶的穩(wěn)定性和保護作用研究中，Ecor Ⅰ，BR Ⅲ， Pst Ⅰ，Hind Ⅲ等在含海藻糖的緩沖液中，于37 ℃通風干燥后的酶，在70 ℃保存35 d 后仍能精確切斷DNA。用海藻糖干燥抗體，無需冷凍保存，待復水后均能恢復活力[9]。

4.4在農(nóng)業(yè)中的應用

隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的深入研究，含海藻糖的轉(zhuǎn)基因植物的建成，不僅可以提高作物的抗旱能力，而且能使作物在收獲加工后顯得新鮮、具有更濃郁的風味。目前英美科學家已使番茄積累海藻糖，并正在研究把基因引入其他水果中。因此，抗旱植物的育成及其發(fā)展將有可能為抵抗旱災、凍災及沙漠改造、綠化荒旱地做出重要貢獻。

4.5在化妝品方面的應用

現(xiàn)在，用于化妝品的主要是海藻糖的衍生物。在日本，海藻糖因其本身所顯示的保濕性已被衛(wèi)生部門確認為新規(guī)格化妝品原料，例如可作為用于唇膏、護膚、洗面等化妝品的甜味劑、改良劑。另外，無水海藻糖在化妝品方面的研究也成為一大熱點。

5展望

在近年來的糖類開發(fā)研究中，海藻糖的研究倍受關(guān)注，對海藻糖的生產(chǎn)技術(shù)及其應用研究頗為活躍。目前，日本林原生化研究所首先開發(fā)出利用酶轉(zhuǎn)化法從淀粉直接生產(chǎn)海藻糖的新技術(shù)，并申請了專利，使日本成為第一個能直接利用淀粉生產(chǎn)海藻糖的國家。我國在海藻糖的研究方面起步較晚，但也獲得了很多令人可喜的成果。最近，劉莉等克隆了硫化菌中新型α-2淀粉酶基因，并表達于大腸桿菌中。山東大學微生物實驗室報道，他們利用基因敲除技術(shù)將酵母中酸性和中性海藻糖酶的活性降低，使菌體內(nèi)海藻糖大量積累，從而提高了轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生產(chǎn)海藻糖的得率。

近年來，我國在海藻糖的基礎理論和應用方面的研究較多，但海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)較少，大多僅僅停留在實驗室階段，轉(zhuǎn)化的成果很少。不過最近有報道，中國科學院微生物研究所通過產(chǎn)酶的基因工程菌株發(fā)酵，分別制備MTSase 和MTHase 的酶制劑，并以淀粉為水解原料，雙酶法聯(lián)合轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖，完成中試，獲得產(chǎn)品成本遠低于酵母提取法制備的海藻糖劑。此外，南寧中諾生物工程有限公司也利用基因工程酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)海藻糖，食用級海藻糖（98 %純度）售價低于79 元/kg，至此，中國已成為第2個能利用淀粉直接生產(chǎn)海藻糖的國家。隨著人們對海藻糖認識的進一步加深，應用范圍的日益擴大，相信海藻糖將逐漸成為21世紀新一代的功能型和保健型食品添加劑和醫(yī)藥原料，走進我們的日常生活[8]。

6參考文獻

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