胎兔皮膚無瘢痕愈合相關(guān)蛋白的篩選與初步分析

李 楊

[摘要]目的：篩選胎兔皮膚組織無瘢痕愈合相關(guān)蛋白，并初步分析其在無瘢痕愈合過程中的作用。方法：建立胎兔背部切割傷模型，運(yùn)用蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)篩選胎兔皮膚傷后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫檢索分析。結(jié)果：篩選出20個(gè)在傷后胎兔皮膚組織中特異高表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫檢索分析后確定：伴侶素或線粒體蛋白P₁前體、彈性蛋白(Vi－mentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(異質(zhì)性胞核核糖核蛋白H)、α烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)等無瘢痕愈合相關(guān)蛋白在胎兔皮膚傷后表達(dá)增加。結(jié)論：上述無瘢痕愈合相關(guān)蛋白可能通過對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控，促進(jìn)膠原蛋白等的合成和正確的折疊、裝配，以及促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育等，促進(jìn)胎兔皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)，參與其無瘢痕愈合過程。

[關(guān)鍵詞]胎兔；皮膚；無瘢痕愈合；創(chuàng)傷：蛋白質(zhì)組；基質(zhì)輔助的激光解析電離／飛行時(shí)間質(zhì)譜

[中圖分類號]R641 Q591．2 R751 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0011－04

自Burrington首次發(fā)現(xiàn)胎兒皮膚創(chuàng)傷后修復(fù)無瘢痕形成，并確立了“無瘢痕愈合”(Scarless Healing、Scar-free Healing)的概念以來，“無瘢痕愈合”模式成為人們孜孜以求的理想，但至今胚胎個(gè)體“無瘢痕愈合”的具體機(jī)制還不清楚。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)在胎兔皮膚創(chuàng)傷無瘢痕愈合過程中確有基因表達(dá)的差異存在，且差異表達(dá)基因可能在其過程中具有重要的作用。而基因最終是通過蛋白質(zhì)的表達(dá)才發(fā)揮其功能，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用雙向電泳技術(shù)，篩選胎兔皮膚無瘢痕愈合相關(guān)蛋白，并進(jìn)行初步分析。

1 材料和方法

1．1動物與試劑：健康雌性大耳白兔20只，體重(3．0～3．5)kg(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心)，“速眠新”合劑(長春農(nóng)牧大學(xué)獸醫(yī)研究所)，哺乳動物總蛋白提取試劑盒(Merck公司)，pH4-7、11cm固相pH梯度(Immoblilized pH gradient，IPG)預(yù)制膠條(Bio-Rad公司)，銀染增強(qiáng)型試劑盒(Bio-Rad公司)。

1．2動物致傷與分組：對20只妊娠20天的雌兔進(jìn)行麻醉后，無菌條件下對胎兔背部致切割傷，傷后繼續(xù)飼養(yǎng)。以20只致傷胎兔作為創(chuàng)傷(Fetal trauma，F(xiàn)T)組，20只同胎未致傷胎兔作為對照組(Fetal control，F(xiàn)C)，20只妊娠兔作為成年創(chuàng)傷對照(Adult trauma control，A7C)組。于傷后24h分別取各組兔傷口處皮膚組織。

1．3總蛋白質(zhì)提?。河貌溉閯游锟偟鞍滋崛≡噭┖刑崛⊥闷つw組織的總蛋白，并用Bradford法測定其濃度。

1．4胎兔皮膚蛋白質(zhì)組雙向電泳：采用pH值范圍4～7、長11cm的IPG膠條進(jìn)行雙向電泳。被動水化；第一向等電聚焦：電壓8000V，總聚焦60000Vh：第二向十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)：分離膠采用10％的丙烯酰胺凝膠，分離膠電流30mA／gel，電泳凝膠用硝酸銀染色的方法進(jìn)行染色。

1．5差異蛋白質(zhì)點(diǎn)選取及初步分析：相同條件下分別對FT、FC、ATC三組兔皮膚總蛋白進(jìn)行三次雙向電泳。凝膠圖譜用ImageMaster 2D Platinum圖像分析軟件分別進(jìn)行分析，并對三組樣品電泳凝膠進(jìn)行差異比較分析。

對F7組特異高表達(dá)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助的激光解析電離／飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrogram，MALDI-TOF-MS)分析，得到各蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜，然后將肽指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，分析其功能。

2 結(jié)果

2．1動物模型：成年雌兔均健康存活；致傷胎兔死亡4只，存活16只，手術(shù)成功率80％；對照胎兔均成活。

2．2皮膚組織總蛋白質(zhì)：各組樣品組織總蛋白濃度分別為：F7組(3．22～4．44)μg/μl、FC組(3．12～4．62)μg/μl、ATC組(16．54～18．96)μg/μl，各組樣品總蛋白量分別為：FT組(3886～4664)μg、FC組(3880~4862)μg、ATC組(12432～14226)μg。

2．3總蛋白質(zhì)雙向電泳及無瘢痕愈合相關(guān)蛋白的篩選：胎兔致傷組3張電泳圖譜上分別檢測到91個(gè)、107個(gè)和117個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，平均蛋白質(zhì)點(diǎn)(105±14)個(gè)；胎兔對照組分別檢測到89個(gè)、107個(gè)和127個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，平均蛋白質(zhì)點(diǎn)(108+19)個(gè)；成年創(chuàng)傷對照組分別檢測到49個(gè)、62個(gè)和89個(gè)，平均蛋白質(zhì)點(diǎn)(67±22)個(gè)。

選取FT組、FC組、ATC組各自三次電泳圖譜中蛋白質(zhì)點(diǎn)分離較好，數(shù)量居中的凝膠作為參考膠，見圖1。將胎兔致傷組的參考膠圖譜分別與胎兔對照組和成年創(chuàng)傷對照組的參考膠圖譜進(jìn)行比對分析，尋找致傷胎兔表達(dá)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，即無瘢痕愈合相關(guān)蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)得到致傷后胎兔皮膚差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)20個(gè)，主要分布在(4．3～6．62)kDa之間(見圖2)。

2．4 無瘢痕愈合相關(guān)蛋白分析：篩選出20個(gè)在傷后胎兔皮膚組織中特異高表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過質(zhì)譜、同源性分析和相似性檢索后，確定其中有意義的蛋白質(zhì)為：伴侶素或線粒體蛋白P．前體、彈性蛋白(Vimentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(異質(zhì)性胞核核糖核蛋白H)、α－烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)。

3 討論

哺乳動物胚胎無瘢痕愈合的機(jī)制至今不清，研究顯示，胎兒具有的無瘢痕愈合的能力可能與其在胚胎期對炎癥的低反應(yīng)性、效應(yīng)細(xì)胞——纖維母細(xì)胞的數(shù)量和功能、細(xì)胞外基質(zhì)的成分和含量以及同源異性盒基因(PRX-2和HOXB13)的表達(dá)差異等有關(guān)，而與胎兒宮內(nèi)的特殊生長環(huán)境無明顯關(guān)系。我們前期實(shí)驗(yàn)從遺傳學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)即尋找基因的差異表達(dá)，用改良的SSH篩選出與胎兔皮膚傷后無瘢痕愈合相關(guān)的基因片段42個(gè)，也提示在胎兔創(chuàng)傷無瘢痕愈合過程中確有基因表達(dá)的差異存在。

通過在相同條件下比較具有表型差異的不同樣品之間蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，尋找與生理／病理現(xiàn)象相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，即有可能揭開某些生理／病理現(xiàn)象的機(jī)制，并提供可以對其進(jìn)行人為干預(yù)的靶點(diǎn)。基于以上思路，我們在相同條件下同步進(jìn)行雙向電泳，比較分析電泳凝膠，尋找切割傷后胎兔皮膚組織的蛋白質(zhì)組與對照未致傷胎兔和對照致傷成年兔皮膚組織的蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異，從而找出胎兔皮膚傷后無瘢痕愈合相關(guān)蛋白質(zhì)，對其進(jìn)行初步的鑒定和分析，了解其在胎兔無瘢痕愈合中的作用，為人為的干預(yù)和治療瘢痕增生過度或增生不良提供理論基礎(chǔ)。

3．1 伴侶素／線粒體蛋白P₁前體：分子伴侶是一類在細(xì)胞內(nèi)能夠協(xié)助其他多肽進(jìn)行折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解的蛋白，并在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架功能、細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的生理作用。分子伴侶分為許多不同的家族，如Hsp100，Hsp90，Hsp70，伴侶素(Hsp60)，DaJ(Hsp40)，Hsp27，家族蛋白粒體蛋白P₁前體(mitochondrial protein P1 precursor)等，這些成員廣泛分布在原核生物及真核生物細(xì)胞中，它們在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊過程中相互協(xié)同，共同發(fā)揮著重要的作用。

線粒體基質(zhì)蛋白P₁前體在往線粒體內(nèi)輸入蛋白質(zhì)和大分子裝配中發(fā)揮作用，協(xié)助輸入蛋白質(zhì)的正確折疊，并能阻止錯(cuò)誤的折疊和促進(jìn)應(yīng)激條件下產(chǎn)生的未折疊多肽的重折疊和正確的裝配。伴侶素／線粒體蛋白P₁前體在胎兔皮膚傷后表達(dá)增加，它們能協(xié)助其他蛋白和多肽的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)、維持正確構(gòu)象的微管蛋白和微絲蛋白，保持正確的細(xì)胞骨架促進(jìn)傷口的愈合。

3．2波形蛋白和微管蛋白β多肽：波形蛋白(Vimmentin，Vim)是中等纖維的主要成分之一，在成纖維細(xì)胞中起到細(xì)胞支架與網(wǎng)絡(luò)的作用。在皮膚結(jié)締組織等間葉起源的細(xì)胞如：成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、某些肌肉細(xì)胞等中，中等纖維也以波形蛋白占絕大部分。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腦穿刺傷后的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中Vim及其mRNA的表達(dá)均增加，且與膠質(zhì)瘢痕的形成關(guān)系密切：在深Ⅱ度和全層皮膚損傷愈合后攣縮瘢痕的研究中發(fā)現(xiàn)，波形蛋白在損傷后明顯的增加，Vim的基因在增生性瘢痕中表達(dá)也增加，因此有研究者認(rèn)為Vim與瘢痕增生有關(guān)。也有實(shí)驗(yàn)觀察到在肌肉損傷和再生過程中Vim表達(dá)也增加，提示Vim可能在組織損傷后的再生和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。

微管是真核細(xì)胞所獨(dú)有的結(jié)構(gòu)，存在于細(xì)胞基質(zhì)，屬于一種保守成分。微管主要由微管蛋白組成，是真核細(xì)胞普遍存在的細(xì)胞骨架，它還參與細(xì)胞的增殖、分化。B微管蛋白與細(xì)胞增殖分化有密切關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞從GO期進(jìn)入S期使細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入增殖狀態(tài)時(shí)，必伴隨β微管蛋白的基因表達(dá)及其蛋白合成。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用燒傷血清刺激大鼠腸上皮細(xì)胞后微管蛋白表達(dá)減弱，該現(xiàn)象可能與腸上皮損傷有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Vim在傷后的胎兔皮膚組織中表達(dá)高于未致傷胎兔和傷后的成年免?？梢栽囅隫im在成年個(gè)體傷后可能促進(jìn)瘢痕的增生，而在胚胎時(shí)期可能具有調(diào)整膠原纖維的排列，抑制瘢痕增生的作用，從而促進(jìn)胎兔創(chuàng)口組織的再生與愈合。胎兔傷后的皮膚中微管蛋白β多肽表達(dá)增多，也提示微管蛋白可能從促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和保護(hù)上皮組織等方面在胎兔皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)中起到一定作用。

3．3 核不均一核糖核蛋白H：核不均一核糖核蛋白(異質(zhì)性胞核核糖核蛋白)(Heterogeneous nuclearribonucleoprotein，hnRNP、是一組RNA結(jié)合蛋白，它包括近30種與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，在基因轉(zhuǎn)錄、核內(nèi)mRNA前處理以及胞質(zhì)的mRNA翻譯時(shí)起重要作用。hnRNP H是hnRNP家族的一個(gè)亞型，主要富集于細(xì)胞核內(nèi)，它作為剪接增強(qiáng)子復(fù)合物的組成部分參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制，其具體機(jī)制是hnRNP H能和相關(guān)蛋白如：hnRNP F等相互作用，其作用方式可能是hnRNP H和相關(guān)蛋白hnRNP F在單個(gè)增強(qiáng)子復(fù)合體中以異源二聚體的形式存在并相互作用，從而完成基因的剪接，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯。Liu等體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hnRNP H通過對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控可以抑制干細(xì)胞的肌形成。本實(shí)驗(yàn)在創(chuàng)傷胎兔的皮膚中觀察到hnRNP H的表達(dá)增加，它可能也通過對基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對相關(guān)蛋白翻譯的調(diào)控，從而發(fā)揮其在無瘢痕愈合中的作用。

3．4 α－烯醇酶：α－烯醇酶能調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子、核呼吸因子l，參與糖分解酶的調(diào)控，它還是細(xì)胞質(zhì)中磷酸烯醇丙酮酸形成過程中重要的糖酵解酶。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)烯醇酶可與人的纖溶酶原、唾液腺粘蛋白MG2結(jié)合，并可能在變形鏈球菌黏附、清除或突破血流屏障中起一定的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α－烯醇酶組成纖溶酶原的受體，而該受體通過在細(xì)胞表面富集纖溶蛋白酶或增強(qiáng)其生成，從而在骨骼肌形成過程中發(fā)揮重要作用。在小細(xì)胞肺癌中α－烯醇酶表達(dá)下調(diào)，并可能在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。但α－烯醇酶在創(chuàng)傷或皮膚組織中的作用和功能鮮有研究，因此其在胎兔皮膚組織無瘢痕愈合中的作用有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)篩選出的蛋白與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育等功能有關(guān)，這一結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)在創(chuàng)傷胎兔皮膚組織中篩選出與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)相互印證。因此可以設(shè)想：胎兔皮膚創(chuàng)傷后Vim、微管蛋白β多肽等促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和發(fā)育，并維持其正常的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)；hnRNP H調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)膠原蛋白等的合成：同時(shí)伴侶素協(xié)助多肽進(jìn)行折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)，并能阻止錯(cuò)誤的折疊和促進(jìn)未折疊多肽的重折疊和正確的裝配；α－烯醇酶可能以酶的身份參與其中，調(diào)節(jié)這些過程的完成。無瘢痕愈合相關(guān)蛋白通過這些作用，可能使膠原纖維等成分維持正常的排列，從而抑制瘢痕的過度增生，參與胎兔無瘢痕愈合過程。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。