ｐ２７基因轉(zhuǎn)染對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞－膠原網(wǎng)收縮的影響

韓軍濤 朱雄翔 王洪濤

[摘要]目的：研究p27對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞－膠原網(wǎng)收縮的影響差異，探討p27在瘢痕形成中的作用。方法：取體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(HTsFb)，p27基因轉(zhuǎn)染HTsFb，建立成纖維細(xì)胞－膠原網(wǎng)模型，觀察p27基因轉(zhuǎn)染對(duì)p27基因轉(zhuǎn)染HTsFb－膠原網(wǎng)收縮的影響差異。結(jié)果：p27能抑制HTsFb－膠原網(wǎng)收縮。結(jié)論：p27可能通過抑制瘢痕收縮來抑制瘢痕形成。

[關(guān)鍵詞]P27；成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)；瘢痕

[中圖分類號(hào)]R619．6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—6455(2007)01—0019－02

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在正常細(xì)胞的生長和腫瘤的發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDKs)是細(xì)胞周期進(jìn)展的主要調(diào)節(jié)因子，CDKs能夠使Rb基因及其相關(guān)蛋白磷酸化，反過來又受到細(xì)胞周期素(cyclin)的水平，磷酸化和細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(CKIs)的控制。作用CDK的抑制蛋白p27，已證明是潛在的腫瘤抑制因子或抑癌基因。p27主要是通過與cyclin E-CDK2復(fù)合物的相互作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1后期到S期。目前認(rèn)為p27是TGF-β、cAMP及其他細(xì)胞外因子誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯的主要介質(zhì)。成纖維細(xì)胞一膠原網(wǎng)系統(tǒng)是研究創(chuàng)面愈合與瘢痕攣縮較為先進(jìn)的三維立體培養(yǎng)模型，我們以成纖維細(xì)胞－膠原網(wǎng)為模型，研究了抑癌基因p27轉(zhuǎn)染對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞－膠原網(wǎng)收縮影響，探討抑制瘢痕攣縮可能的機(jī)制，以期為瘢痕的防治提供新的途徑。

1 材料和方法

1．1材料：p27-pcDNA3真核表達(dá)質(zhì)粒由作者本人構(gòu)建，DMEM為GIBCO公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為DIBCO公司產(chǎn)品，新生小牛血清為上海產(chǎn)。

1．2方法

1．2．1成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及脂質(zhì)體介導(dǎo)的p27基因轉(zhuǎn)染參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

1．2．2鼠尾膠原的提取及定量：取wistar鼠尾2根，750ml／L乙醇浸泡20min，生理鹽水漂洗3次，無菌條件下抽出尾腱，溶于1ml／L醋酸溶液500ml中。4℃下攪拌48h，取上清，紫外分光光度法定量蛋白質(zhì)含量為0．2g/L，用于實(shí)驗(yàn)。 1．2．3成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)凝膠系統(tǒng)的建立取對(duì)數(shù)生長期HTsFb，調(diào)整細(xì)胞濃度為3．0×10⁸／L，將細(xì)胞懸液，10×DMEM，11．76g/L NaHCO₃，0．2g/L鼠尾膠原按2：1：2：5的比例，將四種成分快速混勻，用1mol／L NaOH及0．4mol／L NaOH調(diào)整pH值至中性，形成成纖維細(xì)胞膠原混懸液，將該混懸液移入直徑33mm的培養(yǎng)皿中，2ml／皿，置37℃、50ml／LC02孵箱中10min，混懸液即形成凝膠，輕叩皿底，使凝膠塊和皿底分離，然后每皿加入含10g/LFCS的DMEM 1mL，設(shè)置A：空白對(duì)照：B：pcDNA3：C：DcDNA3-p27三組，繼續(xù)培養(yǎng)，以不同時(shí)間點(diǎn)凝膠塊的面積與初始面積百分比(Percentage of Area)來表示凝膠收縮的程度。

2 結(jié)果p27對(duì)HTsFb膠原網(wǎng)收縮的影響

2．1細(xì)胞形態(tài)與分布：成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)(fibroblast-populated collagen lattice，F(xiàn)PLC)形成時(shí)呈透明狀態(tài)，凝膠化以后變成不透明可被握持的凝膠塊。當(dāng)凝膠與培養(yǎng)皿分離后則凝膠塊和圓盤狀漂浮在培養(yǎng)液表面，在倒置顯微鏡下，可清楚地看到各個(gè)層次的細(xì)胞及其形態(tài)。成纖維細(xì)胞在凝膠中的位置相對(duì)固定，不象在普通二維培養(yǎng)系統(tǒng)中那樣迅速沉淀，說明此時(shí)成纖維細(xì)胞已經(jīng)粘附在膠原支架上，約4～6h后，經(jīng)胰酶消化后呈圓形的成纖維細(xì)胞表面逐漸伸展延長，形成較多的胞質(zhì)突起，隨著時(shí)間的推移，這些突起在細(xì)胞的兩極逐漸伸展延長，但數(shù)目逐漸減少，最后在細(xì)胞的兩極形成兩個(gè)較長的突起，使細(xì)胞大致成長梭形。伴隨著凝膠塊的收縮，成纖維細(xì)胞變得更加致密，有時(shí)互相交織成網(wǎng)狀，A、B、C三組成纖維細(xì)胞的形態(tài)及排列未發(fā)現(xiàn)明顯差異，在早期(24h)內(nèi)，轉(zhuǎn)染P27的C組瘢痕成纖維細(xì)胞伸展開的時(shí)間較早，且收縮速度較A，B組細(xì)胞膠原網(wǎng)快，C組瘢痕成纖維細(xì)胞在相同的時(shí)間點(diǎn)顯得較為致密，但后期(＞24h)收縮速度較A，B組細(xì)胞膠原網(wǎng)快，C組瘢痕成纖維細(xì)胞在相同的時(shí)間點(diǎn)顯得較為稀疏。

2．2 P27對(duì)HTsFb-膠原網(wǎng)收縮的影響：在快速收縮時(shí)相(24h內(nèi))，P27對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的促進(jìn)作用；而在延緩收縮相(超過24h)則對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的抑制作用(見圖1)。

3 討論

傳統(tǒng)的成纖維細(xì)胞體外二維培養(yǎng)方法，使我們能將成纖維細(xì)胞從體內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的因素中分離出來，置于一定的因素控制下，觀察細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而為創(chuàng)面愈合及瘢痕異常增生提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，但是二維培養(yǎng)方法忽視了細(xì)胞外基質(zhì)與成纖維細(xì)胞的相互作用。近年來，很多實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞外基質(zhì)一方面維持正常的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，另一方面與細(xì)胞相互作用、相互依存，對(duì)維持正常的細(xì)胞形態(tài)及增殖分化、合成代謝的功能非常重要。1979年Bell設(shè)計(jì)了FPCL模型，更加類似于體內(nèi)環(huán)境，得到廣泛應(yīng)用。1995年Tsai等用增生性瘢痕和正常皮膚來源的成纖維細(xì)胞形成FPCL，發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕來源的FPCL收縮快，收縮能力強(qiáng)。這些研究中都顯示增生性瘢痕來源的可收縮的FPCL能較好地保持增生性瘢痕的特征，是較為理想的增生性瘢痕體外模型。

含成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)的收縮過程大致上可分為兩個(gè)時(shí)相：①快速收縮時(shí)相：發(fā)生在收縮過程的早期，本實(shí)驗(yàn)主要發(fā)生在24h以內(nèi)；②延緩收縮相，兩收縮時(shí)相之間并無明顯界限．凝膠收縮的過程受細(xì)胞組織來源及其功能狀態(tài)、細(xì)胞濃度、膠原濃度、血清含量及細(xì)胞因子的含量等多種因素的影響，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在快速收縮時(shí)相(24h內(nèi))，P27對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的促進(jìn)作用；而在延緩收縮時(shí)相(超過24h)則對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)收縮有明顯的抑制作用。

成纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)收縮的機(jī)理是由于成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的張力，作用于膠原纖維，使之發(fā)生重排或改構(gòu)，導(dǎo)致固相與液相相互分離的結(jié)果，這一過程對(duì)類似于傷口收縮的過程。我們分析在快速收縮時(shí)相p27對(duì)FPLC收縮的刺激作用提示在傷口愈合早期可能通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞的收縮功能來促進(jìn)創(chuàng)面愈合，而在傷口愈合后期可能通過抑制成纖維細(xì)胞的收縮功能來抑制瘢痕攣縮．其對(duì)成纖維膠原網(wǎng)的作用機(jī)制可能是多方面的，在早期可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種生長因子的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)各種張力纖維，張力蛋白如α-SM actin的表達(dá)、以及微絲微管的數(shù)量改變或排列，以及調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞與膠原之間的粘附、影響成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡等多種途徑來實(shí)現(xiàn)，具體的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。