骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合納米羥基磷灰石／聚乳酸構(gòu)建組織工程骨

劉雪梅

[摘要]目的：了解骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)復(fù)合納米羥基磷灰石／聚乳酸(n—HA／PLA)構(gòu)建組織工程骨的異位成骨作用。方法：選擇6只新西蘭白兔，實(shí)驗(yàn)組于動(dòng)物脊柱左側(cè)肌肉內(nèi)植入MSCs復(fù)合n—HA／PLA構(gòu)建的組織工程骨，對(duì)照組于右側(cè)植入n—HA／PLA生物材料。術(shù)后4、8周取材，行溴脫氧尿嘧啶(Brdu)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)和組織學(xué)觀察。結(jié)果：術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組材料邊緣均可檢測(cè)到Brdu標(biāo)記的MSCs。術(shù)后4、8周，實(shí)驗(yàn)組材料內(nèi)部有新骨形成，隨著時(shí)間推移，新骨量增多，編織骨向板層骨過渡。對(duì)照組材料未見新骨形成。結(jié)論：MSCs復(fù)合n—HA／PLA構(gòu)建的組織工程骨具有很好的異位成骨作用。

[關(guān)鍵詞]骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；納米羥基磷灰石；聚乳酸；組織工程

[中圖分類號(hào)]Q813 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—6455(2007)01—0025－03

目前對(duì)骨組織工程支架材料的研究很多，但尚未找到，種理想的材料。單一類型的支架材料存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，僅靠單一材料很難滿足骨組織工程支架材料的要求。理想的骨組織工程支架材料的制備應(yīng)考慮到無機(jī)陶瓷類材料、合成聚合物材料和天然生物衍生材料的優(yōu)缺點(diǎn)，將有機(jī)材料和無機(jī)材料通過合適的方法組合成復(fù)合材料，模擬天然骨基質(zhì)組成成分，通過促進(jìn)種子細(xì)胞的粘附、增殖和分化，從而發(fā)揮最佳的成骨能力。納米羥基磷灰石／聚乳酸(n—HA／PLA)就是根據(jù)這一原理將無機(jī)材料納米羥基磷灰石與有機(jī)材料聚乳酸通過特殊工藝聚合而成的新型生物材料，本實(shí)驗(yàn)旨在研究復(fù)合生物材料n—HA／PLA作為組織工程支架材料的可行性。

1 材料和方法

1．1 MSCs的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)：取健康新西蘭白兔2只，雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)處備皮消毒，無菌條件下用骨穿針穿刺抽取紅骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，混勻后加入3ml淋巴細(xì)胞分離液(Gibco公司)，1800r／min離心10min，吸除中間層細(xì)胞后再離心，所得細(xì)胞沉淀以1×10⁶／ml密度接種于含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞相互融合達(dá)90％生長面積時(shí)用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳至3代時(shí)，移入含10～8mol／L地塞米松、50mg/L維生素C和10～2mol／Lβ－磷酸甘油鈉的DMEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型經(jīng)鑒定為成骨樣細(xì)胞。移入含0．2％BrdU的無血清培養(yǎng)液(按200μl BrdU／100ml DMEM培養(yǎng)液的比例配制)中，于37℃、5％C0₂飽和濕度條件下培養(yǎng)1h標(biāo)記細(xì)胞。

1．2組織工程骨的制備：n-HA／PLA由美國印第安那大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物工程研究室提供，材料規(guī)格為１5mm×10mm×5mm大小，環(huán)氧乙烷消毒后備用。將n-HA／PLA支架材料用DMEM培養(yǎng)液浸泡1天后棄殘液，每個(gè)支架材料以1×10⁶／ml密度接種經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs，于37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養(yǎng)3天。術(shù)前清晨更換不含青霉素和鏈霉素的無血清培養(yǎng)液。

1．3動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組：6只新西蘭白兔全身麻醉，常規(guī)消毒頸背部，于脊柱棘突兩側(cè)各作長約2cm切口，依次切開皮膚和皮下組織，顯露肌組織，分開肌間隙，將移植材料植入肌腹內(nèi)，逐層縫合切口。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身作對(duì)照，于動(dòng)物脊柱左側(cè)肌肉內(nèi)植入組織工程骨，右側(cè)植入單純支架材料。

1．4 檢測(cè)項(xiàng)目

1．4．1大體觀察：術(shù)后觀察動(dòng)物飲食、活動(dòng)，傷口有無腫脹、分泌物等。術(shù)后4周處死動(dòng)物，取出移植材料，觀察移植物的顏色、質(zhì)地和血管形成，與周圍軟組織分布情況。

1．4．2 BrdU標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)：術(shù)后4周部分標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定1周后，乙醇梯度脫水。有機(jī)樹脂包埋，硬組織切片機(jī)制作厚度為5μm切片標(biāo)本，用免疫組化的方法檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞。切片標(biāo)本用0．3％H₂O₂一甲醇處理30min滅活內(nèi)源性氧化酶，5％正常兔血清封閉，甲酰胺100℃變性核酸5min，冰浴冷卻后PBS洗滌，加工作濃度為1：50的小鼠BrdU單克隆抗體。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。顯微鏡下觀察，細(xì)胞核內(nèi)棕色顆粒為陽性細(xì)胞。

1．4．3組織學(xué)觀察：標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定，用10％EDTA脫鈣，常規(guī)脫水、浸蠟和包埋，石蠟切片厚度5μm，行HE染色，顯微鏡下觀察植入材料內(nèi)新骨形成的情況。

2 結(jié)果

2．1大體標(biāo)本觀察：術(shù)后8周，各組植入材料周圍軟組織未見壞死、化膿、積液等現(xiàn)象，可見各組材料有大量纖維組織和血管等軟組織包裹和長入，很難將其分離。

2．2 BrdU標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)：將BrdU標(biāo)記的MSCs與n-HA／PLA支架材料復(fù)合物植入動(dòng)物體內(nèi)，術(shù)后4周取出標(biāo)本，免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞，支架材料邊緣可檢測(cè)到BrdU標(biāo)記的MSCs(圖1)，MSCs呈陽性反應(yīng)，陽性物質(zhì)為棕黃色細(xì)顆粒，分布于MSCs細(xì)胞內(nèi)，陰性對(duì)照中細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)未見陽性信號(hào)。

2．3組織學(xué)觀察結(jié)果：術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本可見有軟骨帶形成，其中有少量鈣化的骨組織，周圍可見梭形的間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化(圖2)。術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本可見有編織骨形成，并可見髓腔形成，其內(nèi)見有島狀骨小梁，周邊仍可見軟骨細(xì)胞。隨植入時(shí)間的延長，組織工程骨逐漸被降解吸收，且新骨或軟骨形成增多，并有血管、纖維組織、脂肪、肌肉組織長入材料間隙內(nèi)。術(shù)后4周和8周，對(duì)照組植入的生物材料中未見任何軟骨或新骨形成，隨著植入時(shí)間的延長，材料逐漸被降解吸收，可見周圍的肌肉組織、纖維組織和血管等由外向內(nèi)逐漸長入材料孔隙內(nèi)(圖3)。

3 討論

羥基磷灰石(hydroapatite，HA)作為骨修復(fù)材料最大缺點(diǎn)是生物力學(xué)強(qiáng)度明顯低于正常骨，這就決定了HA只能作為充填材料，不適用于負(fù)重骨缺損的修復(fù)。同時(shí)HA移植修復(fù)骨缺損，在新骨形成和材料降解吸收的過程中，新骨不能完全恢復(fù)至HA移植前的形態(tài)，形成的新骨量具有不可預(yù)測(cè)性。因此HA不適用于負(fù)重骨缺損的修復(fù)，或是對(duì)外形要求很高的頜面外科修復(fù)。將無機(jī)材料納米羥基磷灰石與有機(jī)材料聚乳酸通過特殊工藝聚合而成的新型生物材料n-HA／PLA，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和成分與人體骨中磷灰石晶體結(jié)構(gòu)相似。與普通HA相比較，n-HA／PLA具有良好的骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性和生物相容性，并且其生物力學(xué)強(qiáng)度，特別是抗壓、抗折彎和彈性模量與人體皮質(zhì)骨相近。n-HA／PLA的主要礦物相為低結(jié)晶度和納米量級(jí)含碳酸根的羥基磷灰石，與入骨的天然成分相同，因此n-HA／PLA具有良好的組織親和性和結(jié)合力。研究表明骨替代材料相互連通的孔隙是新骨形成的先決條件：100～500μm的孔徑有利于成骨細(xì)胞黏附生長、爬行替代和牛物礦化過程；孔徑在40～100μm之間，只能產(chǎn)生類骨質(zhì)；孔徑小于40μm，則只能產(chǎn)生肉芽組織。本實(shí)驗(yàn)采用的n-HA／PLA生物材料網(wǎng)孔平均孔徑為300μm，孔隙率為80％，具有三維立體網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，仿生生物骨的骨小梁、小梁間隙和骨內(nèi)管腔結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于種子細(xì)胞的粘附和生長，并可為細(xì)胞外基質(zhì)的分泌提供寬大表面積和內(nèi)部空間。本實(shí)驗(yàn)中MSCs在n-HA／PLA支架材料上黏附、增殖、分化良好，表明n-HA／PLA是一種較好的骨組織工程支架材料。

異位成骨是指在肌肉等非骨組織內(nèi)成骨，正位成骨是指在骨膜下或骨組織內(nèi)成骨。由于異位成骨具有正位成骨的所有形態(tài)結(jié)構(gòu)和代謝特性，排除正位骨化由于受體骨或骨膜成骨的假陽性結(jié)果，容易解釋新骨形成的細(xì)胞來源，則研究結(jié)果更為真實(shí)可信L6)。本實(shí)驗(yàn)將BrdU標(biāo)記的MSCs復(fù)合n-HA／PLA構(gòu)建組織工程骨植入動(dòng)物肌肉內(nèi)進(jìn)行異位成骨的研究。BrdU與脫氧尿嘧啶結(jié)構(gòu)相似，BrdU能在細(xì)胞周期S期專一摻入DNA，且BrdU單克隆抗體不與胸腺嘧啶發(fā)生交叉反應(yīng)，故BrdU標(biāo)記細(xì)胞具有很高的準(zhǔn)確性和安全性，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究中。BrdU標(biāo)記細(xì)胞一般在體內(nèi)8周可檢測(cè)到，最長不超過12周。本研究結(jié)果表明，將Br-dU標(biāo)記的MSCs與n-HA／PLA支架材料復(fù)合物植入動(dòng)物體內(nèi)，術(shù)后4周取出標(biāo)本，免疫組化方法檢測(cè)標(biāo)記細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組材料邊緣均可檢測(cè)到BrdU標(biāo)記的MSCs，陰性對(duì)照中細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)未見陽性信號(hào)。以上結(jié)果說明組織工程骨的種子細(xì)胞在宿主體內(nèi)存活、生長、增殖和分化，分泌含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β等骨源性生長因子的基質(zhì)，誘導(dǎo)結(jié)締組織中的間充質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞或滑膜細(xì)胞向軟骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化，通過膜內(nèi)化骨或軟骨內(nèi)化骨形成新骨；骨源性生長因子通過細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)趨化破骨細(xì)胞的聚集，降解并吸收材料以促進(jìn)更多的新生骨形成。本研究結(jié)果表明，沒有復(fù)合MSCs的生物材料未見任何軟骨或骨組織形成，而組織工程骨均有軟骨或骨組織形成，說明單純的生物材料只起支架作用，組織工程骨異位成骨的細(xì)胞來源于MSCs，表明構(gòu)建組織工程骨復(fù)合種子細(xì)胞是必需的。本研究中還發(fā)現(xiàn)，組織工程骨體內(nèi)植入后先有軟骨形成，后經(jīng)形態(tài)發(fā)生形成骨組織，進(jìn)一步表明支架材料復(fù)合MSCs體內(nèi)成骨是通過軟骨化成骨，其吋能機(jī)制是MSCs先分化生成軟骨組織，而支架材料降解后釋放的鈣則沉積于軟骨基質(zhì)以促進(jìn)軟骨鈣化形成骨組織。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。