靜脈移植５－ＢｒｄＵ標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與創(chuàng)面愈合的作用研究

[摘要]目的：探討經(jīng)尾靜脈移植入體內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)參與皮膚創(chuàng)面愈合的情況。方法：以SD大鼠為研究對(duì)象，分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠BMSCs。制作大鼠全層皮膚缺損動(dòng)物模型；經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)5一BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)(3、7、14、21、28天)觀察移植細(xì)胞參與創(chuàng)面愈合的情況。結(jié)果：經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表達(dá)CD29、CD90表達(dá)陽性：CD45表達(dá)呈陰性；經(jīng)體外標(biāo)記的5一溴脫氧尿嘧啶標(biāo)記率，90％；標(biāo)記后的干細(xì)胞進(jìn)行移植4周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面局部及邊緣可見BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞聚集，對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象。結(jié)論：5－BrdU完全能夠滿足移植細(xì)胞的標(biāo)記需要。經(jīng)尾靜脈注射移植入體內(nèi)的BMSCs可能參與皮膚創(chuàng)面愈合。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；5－BrdU；細(xì)胞移植；創(chuàng)面愈合

[中圖分類號(hào)]Q813．1⁺1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—6455(2007)01—0028－03

創(chuàng)傷是外科的一大類疾病，隨著對(duì)創(chuàng)傷愈合研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)參與創(chuàng)面修復(fù)的細(xì)胞不僅有定居于損傷組織局部的干細(xì)胞，骨髓來源的干細(xì)胞(bone marrow derived cells)在創(chuàng)傷愈合中的作用逐漸受到重視。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCS)是存在于骨髓組織中的一類成體干細(xì)胞(adun stem cells，AS)，在一定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，骨骼肌、平滑肌、造血支持基質(zhì)等中胚層細(xì)胞分化的能力；同時(shí)可以向外胚層的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、表皮或上皮組織及內(nèi)胚層的肝卵圓細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞分化。BMSCs跨系、甚至跨胚層橫向分化的可塑性及其強(qiáng)大的分化潛能使得它可為組織修復(fù)提供各種細(xì)胞材料。

我們通過建立經(jīng)體外5－BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和局部皮膚缺損動(dòng)物模型，研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過程中的遷移、聚集和增殖情況，以期完善對(duì)創(chuàng)面愈合機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1．1材料：雄性SD大鼠(東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，L-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(FCS，杭州四季青生物材料有限公司)，胰蛋白酶(華美生物工程公司)，CO₂培養(yǎng)箱(Heraeus)，熒光標(biāo)記小鼠抗大鼠單克隆抗體CD45、CD29、CD90 (美國(guó)PharMingen公司)。小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG、DAB顯色劑(北京中山生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(福州邁新公司)。

1．2方法

1．2．1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化、擴(kuò)增和鑒定。

1．2．1．1細(xì)胞培養(yǎng)：選用六周齡健康SD大鼠(約150g，雌雄不限)引頸處死，碘酒浸泡5min，75％酒精脫碘5min：無菌條件下沿股骨髖關(guān)節(jié)股骨大轉(zhuǎn)子處，剪下后肢，剔出股骨和脛骨放入培養(yǎng)皿，加PBS洗滌，移入培養(yǎng)皿加培養(yǎng)液；抽培養(yǎng)液注入股骨和脛骨，沖出骨髓，反復(fù)沖洗2～3次；將含骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)液移入離心管，置離心機(jī)離心800r／min，8min棄上清液，加1ml胎牛血清，4ml培養(yǎng)液，(制成含20％胎牛血清培養(yǎng)液)與細(xì)胞混勻；移入培養(yǎng)瓶，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱孵育。4天后首次換液，以后3～4天換，次，7～10天鋪滿瓶底，待長(zhǎng)滿80％左右進(jìn)行傳代。取培養(yǎng)的第五代細(xì)胞備用。

1．2．2．2流式細(xì)胞儀檢測(cè)：流式細(xì)胞儀對(duì)P3－P5代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入熒光標(biāo)記抗體FITC，室溫避光孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-SCs的表面標(biāo)記：選取間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物：如CD29、CD90，造血干細(xì)胞典型的表面標(biāo)志CD45作為鑒定指標(biāo)。

1．2．2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的5－BrdU標(biāo)記：取第五代細(xì)胞，細(xì)胞移植前48h，以含5μmol／L 5－溴脫氧尿嘧啶(5－BrdU)的培養(yǎng)液孵育后，0．25％胰酶室溫下消化、離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、收集細(xì)胞。

培養(yǎng)瓶中置入0．5cm×1．0cm無菌玻片，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底60％時(shí)(原代培養(yǎng)第9天；傳代培養(yǎng)第5天)加入5－BrdU溶液10μl(5-BrdU，50mg；二甲基亞砜0．8ml；水1ml)．孵育48h。取出玻片，PBS沖洗，4％多聚甲醛固定15min，進(jìn)行免疫組化染色鑒定。

1．2．4全層皮膚缺損動(dòng)物模型的建立：戊巴比妥麻醉大鼠(30mg／kg)，在其背部脊柱兩側(cè)旁開2cm，利刀全層切除皮膚，形成直徑1．8cm、面積2．54cm²的圓形全層皮膚切除創(chuàng)面，凡士林紗布覆蓋創(chuàng)面，打包法處理傷口。

1．2．5實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)每只動(dòng)物按步驟(1．2．4)制作創(chuàng)傷模型，對(duì)成模動(dòng)物經(jīng)尾靜脈注射5－BrdU標(biāo)記的BMSC細(xì)胞，進(jìn)一步制作BMSC細(xì)胞移植動(dòng)物模型作為實(shí)驗(yàn)組，移植細(xì)胞數(shù)為2×10⁷。對(duì)照組為5-Br－dU標(biāo)記的BMSC移植的正常大鼠。

1．2．6免疫熒光染色：分別于創(chuàng)傷后3、7、14、21、28天等不同時(shí)間點(diǎn)分批處死動(dòng)物，取創(chuàng)面及邊緣的組織，4％甲醛固定，50％蔗糖脫水，制作連續(xù)冰凍切片，順序加入一抗和F17C標(biāo)記的二抗，以非特異血清代替一抗作為陰性對(duì)照，室溫下孵育2h，PBS洗片、封片。熒光顯微鏡觀察，5－BrdU標(biāo)記的骨髓BMSCs胞核為綠色熒光。

2 結(jié)果

2．1 BMSC傳代、擴(kuò)增與鑒定：?jiǎn)蝹€(gè)骨髓細(xì)胞懸液接種于25cm²塑料培養(yǎng)瓶，細(xì)胞48h開始貼壁，在瓶底呈散在圓形分布，72h后可見三角形和梭形細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，換液去除未貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)5～7天后細(xì)胞分裂增殖明顯，出現(xiàn)形態(tài)均一的細(xì)胞增殖集落。培養(yǎng)至10天左右，90％以上細(xì)胞趨于融合。經(jīng)胰酶消化后1：2傳代，傳代后6～8h內(nèi)細(xì)胞90％以上貼壁。24h后開始增殖，細(xì)胞集落增多，呈旋渦狀生長(zhǎng)，3天可傳代，連續(xù)傳4～5代后MSCs趨于純化，融合成片狀。

2．2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原表達(dá)：流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好，達(dá)99％以上，造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD45表達(dá)呈陰性：而間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記CD29、CD90等表達(dá)陽性，說明傳代貼壁生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞為BMSCs。

2．3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的5－BrdU標(biāo)記情況：以5μmol／L 5－溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)的培養(yǎng)液孵育后，經(jīng)0．25％胰酶室溫下消化、離心、洗滌、收集細(xì)胞，于顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。如圖所示，BrdU陽性反應(yīng)物位于細(xì)胞核，呈棕色、顆粒狀或彌漫性分布(圖3、4)；以48h作為最佳標(biāo)記時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)數(shù)取10個(gè)非重疊視野進(jìn)行觀察(×100)，記錄陽性細(xì)胞數(shù)，標(biāo)記率＞90％。

2．4大體觀察：細(xì)胞移植3天后實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物創(chuàng)面有所縮小，可見新生肉芽組織生成；7天時(shí)所有創(chuàng)面均形成較硬的痂皮；14天時(shí)創(chuàng)緣有新生表皮生成：傷后21天大部分創(chuàng)面愈合。

2．5骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與創(chuàng)面愈合情況：細(xì)胞移植后第7、14、21、28天，實(shí)驗(yàn)免疫熒光化學(xué)染色，切片中均可見到經(jīng)5-BrdU標(biāo)記(胞核呈綠色熒光)的骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面邊緣和創(chuàng)傷局部的聚集(圖5)，對(duì)照組大鼠相同部位皮膚組織中未見該細(xì)胞明顯的聚集現(xiàn)象，僅見少量5－BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的散在分布(圖6)。

3 討論

對(duì)于骨髓來源的干細(xì)胞在皮膚創(chuàng)面愈合中的作用，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者進(jìn)行過一系列的探討。Krause等將標(biāo)記有PKH26的雄性B6D2F小鼠的骨髓干細(xì)胞注入射線照射后的免疫缺陷的雌性B6D2F小鼠體內(nèi)，5至11個(gè)月后，在受體皮膚中找到了含Y染色體的細(xì)胞。方利君，艾國(guó)平等學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面微環(huán)境的誘導(dǎo)下，局部注射的BMSCs具有向成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞乃至皮脂腺導(dǎo)管細(xì)胞分化的潛能。Carrie等經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察到在正常皮膚和創(chuàng)面皮膚的愈合的過程中，15％～20％的紡錘形真皮成纖維細(xì)胞來自于骨髓。由此可見，骨髓來源的干細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合中的作用逐漸受到重視。

移植細(xì)胞的標(biāo)記及在活體內(nèi)的跟蹤在此類研究中起著不可或缺的作用。目前的細(xì)胞標(biāo)記方法主要有酶聯(lián)標(biāo)記、3H-TdR標(biāo)記、熒光標(biāo)記、BrdU標(biāo)記法等。BrdU作為一種嘧啶類似物，在細(xì)胞處于DNA合成摻入新合成的DNA中，在胞核的DNA中長(zhǎng)期存留，標(biāo)記BrdU的細(xì)胞在不受到紫外線的照射的情況下對(duì)細(xì)胞沒有功能損害。近年來，國(guó)內(nèi)外已有人將該技術(shù)應(yīng)用到移植細(xì)胞的存活、分化和功能狀態(tài)的跟蹤檢測(cè)，標(biāo)記和檢測(cè)的準(zhǔn)確性高、標(biāo)記率高、方法簡(jiǎn)便、迅速、安全，是反映細(xì)胞增殖及跟蹤監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞的理想指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用BrdU標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并采用抗BrdU單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，體外觀察顯示，48h后細(xì)胞標(biāo)記率＞90％，細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖及分化未受影響。細(xì)胞移植4周后，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)仍可檢測(cè)到標(biāo)記細(xì)胞的存在。

我們?cè)趯?duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記的基礎(chǔ)上，將5－BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由尾靜脈注入受試鼠體內(nèi)，同時(shí)制作皮膚缺損創(chuàng)傷模型，第1、2、3、4周處死受試鼠，經(jīng)免疫熒光檢測(cè)可見：經(jīng)5-BrdU標(biāo)記的骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面邊緣和創(chuàng)傷局部的聚集(見免疫熒光照片)，而受試鼠正常皮膚組織未見該細(xì)胞的明顯聚集現(xiàn)象，僅見5－BrdU標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的散在分布，此結(jié)果初步證實(shí)經(jīng)尾靜脈注入的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與了創(chuàng)面愈合?；诖?，我們將進(jìn)一步研究骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過程中的遷移、增殖、分化情況，以期完善對(duì)創(chuàng)面愈合機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為促進(jìn)新的治療手段和策略提供理論依據(jù)。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。