ＳＤ大鼠糖尿病創(chuàng)面與正常創(chuàng)面中ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３的表達(dá)差異

徐 蓉 范 斌 徐文彬 金 偉 肖秀麗 王一飛

[摘要]目的：通過(guò)觀察大鼠正常創(chuàng)面與糖尿病模型創(chuàng)面肉芽組織中／GF－β1、TGF－β3不同時(shí)段表達(dá)水平的差異，探求糖尿病創(chuàng)面“難愈”的可能機(jī)制。方法：采用SD大鼠實(shí)驗(yàn)性正常創(chuàng)面及糖尿病創(chuàng)面背部全層皮膚缺損模型，分別于不同時(shí)段(3天、7天、11天)取材，EnVision二步法免疫組化測(cè)定，并行圖像掃描定量分析TGF-β1、TGF-β3水平變化。結(jié)果：創(chuàng)傷后3天、7天和11天，正常創(chuàng)面模型組TGF-β1表達(dá)分別為(25．56±6．86)、(24．79±5．62)和(28．57±6．39)，TGF-β3表達(dá)分別為(39．69±5．46)、(23．20±2．45)、(13．69±3．63)。而糖尿病潰瘍模型組TGF-β1表達(dá)分別為(7．10±3．74)、(9．47±1．72)和(7．87±2．53)，TGF-β3表達(dá)分別為(14．99±1．87)、(18．72±5．01)和(8．68±3．39)。糖尿性創(chuàng)面肉芽組織中各時(shí)段(3天、7天和11天)TGP-β1及TGF-β3表達(dá)水平均低于正常創(chuàng)面組(P＜0．05)。結(jié)論：SD大鼠糖尿病創(chuàng)面TGF-β1及TGF-β3的低水平表達(dá)，可能是創(chuàng)面愈合遲緩的原因之一。

[關(guān)鍵詞]糖尿?。簞?chuàng)面愈合；TGFβ

[中圖分類(lèi)號(hào)]R641 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008—6455(2007)01—0035－03

TGF－β是參與創(chuàng)面愈合全過(guò)程的重要因子，近來(lái)有國(guó)內(nèi)外研究表明：創(chuàng)面難以愈合往往和生長(zhǎng)因子的缺乏有關(guān)。我們以SD大鼠實(shí)驗(yàn)性正常創(chuàng)面與糖尿病潰瘍模型為研究平臺(tái)，動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)段新生肉芽組織中TGF－β₁、TGF－β₃水平的變化，從生長(zhǎng)因子水平闡明糖尿病性創(chuàng)面的部分機(jī)制。

1 材料和方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：48只清潔級(jí)SD(sprague-dawly)大鼠，雄性，質(zhì)量(250±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(批號(hào)醫(yī)動(dòng)字第04-20-3號(hào))。糖尿病造模后隨機(jī)分為3天、7天和11天三個(gè)觀測(cè)時(shí)段。每個(gè)時(shí)段又分為正常創(chuàng)面生理鹽水組、糖尿病創(chuàng)面生理鹽水組。每組各8只動(dòng)物。

1．1．1主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1．1．2大鼠創(chuàng)面模型制備用藥：新潔爾滅酊，0．9％生理鹽水(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供)。0．1％鹽酸氯胺酮(上海中西藥業(yè)股份公司產(chǎn)品)。四氧嘧啶(Auoxan)，試劑編號(hào)：2244-11-3。瑞士FULKA公司產(chǎn)品(由上海中醫(yī)藥大學(xué)藥理毒性實(shí)驗(yàn)室提供)。羅氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖儀和血糖測(cè)試試紙，編號(hào)：2005—10，22896931，瑞士Roche公司產(chǎn)品。 1．1．3免疫組化試劑和儀器：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β₁多克隆抗體，工作濃度1：200；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β₃多克隆抗體，工作濃度1：200，均為北京中山生物工程公司產(chǎn)品；二抗抗體(生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體)，工作濃度1：200，美國(guó)Vector公司產(chǎn)品。EnVision試劑盒，工作濃度1：100，日本DAKO公司產(chǎn)品。3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，瑞士Fluke公司產(chǎn)品；BX51／BX52系統(tǒng)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品。SX-100計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)IBM公司產(chǎn)品。

1．2方法

1．2．1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(上海中醫(yī)藥大學(xué)岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)

1．2．2糖尿病大鼠模型制備：糖尿病大鼠模型制備參照傅小兵等方法改進(jìn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，禁食24h后(飲水不限)，分別在乙醚麻醉下尾靜脈一注射1．5％四氧嘧啶(50mg／kg，實(shí)驗(yàn)組)及等體積生理鹽水(對(duì)照組)，造模后4h后給予5％葡萄糖水溶液飲用，次日經(jīng)尾部取血測(cè)血糖，血糖值大于10mmol／L上，則表明造模成功。模型制成后，實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分三組，每三天測(cè)血糖一次，直到動(dòng)物處死。

1．2．3動(dòng)物糖尿病創(chuàng)面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后三天，參照傅小兵等方法改進(jìn)，SD大鼠用1％鹽酸氯胺酮(0．3ml／100g)腹腔注射麻醉。局部備皮，常規(guī)消毒后，于SD大鼠背部取直徑為3cm左右圓形切口，剪開(kāi)皮膚全層，至皮下筋膜，無(wú)菌敷料加蓋，每日換料一次。

1．2．4動(dòng)物標(biāo)本采取：用藥后第3天、7天、11天，將動(dòng)物麻醉(氯胺酮)處死，用眼科手術(shù)剪分離新生創(chuàng)面肉芽組織，并成塊取下，為所需實(shí)驗(yàn)樣品。

1．2．5免疫組化實(shí)驗(yàn)：(上海復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室和上海中醫(yī)藥大學(xué)藥理毒性實(shí)驗(yàn)室)6組(3個(gè)吋段，每個(gè)時(shí)段分2組)標(biāo)本均用10％中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，每例分別進(jìn)行HE染色。(用以對(duì)照病理診斷)，并同時(shí)、同一試劑進(jìn)行免疫組化EnVision二步法測(cè)定／FGβ1、TGFβ3。

1．2．6EnVision二步法測(cè)定：取存檔蠟塊制成5μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。將切片移入電飯煲水浴中(內(nèi)含0．01mol／1 Ph6．0的檸檬三鈉緩沖液)，溫度保持在95～100℃，煮20min，保溫10min，進(jìn)行抗原修復(fù)，取出后在室溫下自然冷卻。TBS洗滌，5min3次。滴加一抗(分別為上述抗體及相應(yīng)抗體稀釋度)在濕盒中室溫下(20℃～25℃)孵肓60min后移入4℃冰箱過(guò)夜。TBS洗滌3次。滴加EnVision反應(yīng)液(抗鼠，抗兔)，50μl／片，室溫下孵育30min。TBS洗滌3次。0．05％DAB+0．03％H₂0₂顯色5～10min。流水洗，蘇木素襯染，鹽酸酒精分化，藍(lán)化。遞增梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)樹(shù)脂封片。對(duì)照設(shè)置：顯微鏡下觀察：有棕黃色染者為陽(yáng)性對(duì)照，用TBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1．2．7免疫組織化學(xué)陽(yáng)性著色的定量分析：染色結(jié)果應(yīng)用Image-pro plus 4．1版本計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)在40倍顯微鏡下計(jì)算區(qū)域的陽(yáng)性面積百分比(％)，求出10個(gè)視野平均值(x±s)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)資料均數(shù)的雙側(cè)t檢驗(yàn)，P＜0．05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1．2．8創(chuàng)面面積：采用透明薄膜稱(chēng)量法。創(chuàng)傷后3天、7大、11天，分別用透明薄膜覆蓋創(chuàng)面沿創(chuàng)緣畫(huà)膜，剪膜，置分度值為0．1mg的電子天平稱(chēng)取質(zhì)量并轉(zhuǎn)換成面積。

2 結(jié)果

各治療組不同時(shí)段TGF-β1、TGF-β3水平變化詳見(jiàn)表1、2、3。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，三個(gè)不同時(shí)段(3天、7天、11天)，糖尿病創(chuàng)面生理鹽水組均低于正常創(chuàng)面生理鹽水組(P＜0．05)。

3 討論

糖尿病是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病。糖尿病性潰瘍，特別是足部潰瘍發(fā)病率較高，是糖尿病患者的常見(jiàn)并發(fā)癥之一。造成糖尿病潰瘍遷延難愈的原因有很多，可能和局部生長(zhǎng)因子缺乏，細(xì)胞外基質(zhì)改變，成纖維細(xì)胞功能降低，白細(xì)胞的抗菌活性降低和患處體循環(huán)、微循環(huán)紊亂等有關(guān)。其中對(duì)生長(zhǎng)因子的研究，是目前創(chuàng)面愈合的研究熱點(diǎn)。

創(chuàng)傷修復(fù)的快慢取決于修復(fù)細(xì)胞進(jìn)入傷口和增生的速度，而細(xì)胞的進(jìn)入和增生又依賴(lài)于趨化因子和生長(zhǎng)因子的參與。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是近來(lái)創(chuàng)面愈合研究中的熱點(diǎn)。它是創(chuàng)面細(xì)胞外基質(zhì)積聚過(guò)程中的主導(dǎo)介質(zhì)，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)smad2和smad3介導(dǎo)的信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)目的基因表達(dá)和蛋白合成。

在哺乳類(lèi)動(dòng)物中，有三種子GF-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。它們彼此的分子結(jié)構(gòu)不盡相同，結(jié)合細(xì)胞受體的方式也不同，但卻有著相似的生物學(xué)活性，對(duì)諸如細(xì)胞分化、增殖、細(xì)胞黏附、骨骼形成、血管生成、炎癥反應(yīng)和創(chuàng)面愈合的調(diào)控在生物學(xué)方面有著舉足輕重的影響。有研究證實(shí)TGF-β既可直接作用于成纖維細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白合成，體外低濃度的TGF—β即可刺激成纖維細(xì)胞合成大量膠原基質(zhì)。已有研究表明：糖尿病創(chuàng)面通常表現(xiàn)為修復(fù)不足，通過(guò)增加TGF-β1的合成與釋放，可以增加糖尿病燒傷創(chuàng)面的血管形成，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：糖尿病創(chuàng)面的生理鹽水組在傷后3～11天的創(chuàng)面中TGF-β1、TGF-β3的表達(dá)量始終較低，3天和11天比較幾乎沒(méi)有明顯變化(P＜0．05)。而創(chuàng)傷后3天內(nèi)TGF-β3水平高于TGF=β1(P＜0．05)，可能和創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。正常創(chuàng)面組，在創(chuàng)傷后3～11里，TGF-β1一直保持在較高水平，TGF-β3隨創(chuàng)面愈合而逐漸下降。正常創(chuàng)面組TGF-β1水平始終高于糖尿病性創(chuàng)面組。研究結(jié)果顯示糖尿病性創(chuàng)面難以愈合的原因可能與低水平表達(dá)的TGF-β有關(guān)。

編輯／張惠娟

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