天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料骨相容性研究（一）

劉 偉 路新強

[摘要]目的：觀察天然羥基磷灰石(Hydroxyaptite HA)／殼聚糖(Chitosan)復合材料(NHC)的骨組織相容性及與骨發(fā)生結合的界面情況。方法：將天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料植入兔顱骨中，用CT、三維CT和掃描電鏡進行組織形態(tài)學方面的觀察研究。結果：NHC植入后，植入體周圍逐漸形成新骨，膠原成分逐漸成熟并減少。6個月時NHC于周圍骨大部分發(fā)生融合，10個月時NHC與宿主骨發(fā)生牢固結合，成一骨性整體。結論：NHC有良好的骨組織相容性，能與骨發(fā)生骨整合。

[關鍵詞]羥基磷灰石；殼聚糖；復合材料：骨；相容性

[中圖分類號]R782．5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0031－04

天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料是由豬骨提取的并經(jīng)羥基磷灰石和殼聚糖交聯(lián)法獲得的(該材料合成方法已獲得國家專利)。其抗壓強度達到人椎骨水平。理論上本復合材料同時擁有羥基磷灰石所具有的良好的生物相容性，以及引導骨形成、骨融合的特性和殼聚糖的體內(nèi)降解吸收，并具有高強度、抗菌抗癌和良好的骨整合等特殊的醫(yī)用生物學特性。同時長期植入體內(nèi)由于殼聚糖的吸收，允許骨組織長入殼聚糖吸收后留下的位點并和羥基磷灰石交錯交聯(lián)骨整合在一起。為一種新復合成的材料，我們需要對其進行生物學安全評定。本文是該材料的生物學系列研究的一部分，通過掃描電鏡、CT和三維CT進行觀察對其骨組織相容性和其與骨組織結合的界面進行研究。

1 材料和方法

1．1實驗材料：天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料由東南大學生物醫(yī)學工程系吳健雄國家重點實驗室呂曉迎教授生物材料研究小組完成、提供。材料制作規(guī)格為：直徑10mm、高2mm的圓柱形。材料均用超聲波清洗，高溫高壓消毒備用。

1．2動物實驗

1．2．1實驗動物：體重2．5kg左右新西蘭大耳白兔10只，雌雄不限。

1．2．2 3％戊巴比妥鈉1ml／kg兔耳緣靜脈麻醉后，常規(guī)頭部備皮，消毒，鋪巾。做縱行長約3cm頭皮切口，剝離骨膜顯露頂骨，用慢鉆(4000r／s)在頂骨上做直徑為1．2cm圓形標準骨缺損。將材料放入骨缺損內(nèi)，使材料和骨之間留有1mm的間隙，嚴密縫合皮膚，關閉創(chuàng)口。同時做無材料修復的骨缺損空白對照。術后常規(guī)40萬U青霉素肌肉注射。

1．3術后檢查及結果處理

1．3．1臨床觀察。

1．3．2術后6個月和10個月行C／和三維CT標本檢測。

1．3．3術后1、4、12、24和40周各處死一只兔子。取標本，并將標本縱劈成兩部分，置于2．5％戊二醛(4℃冰箱)中固定24h以上，PBS沖洗24h，1．0％鋨酸固定2h，再用PBS沖洗，脫水(70％丙酮10min，90％丙酮10min，100％丙酮10min、30min、5h)，二氧化碳臨界點干燥。用EIKO IB－3IONCOATER噴金。用HITACHI(日立)S-520 Scanning Electron Microanalyzer(SEM)觀察材料和骨結合界面。

2 結果

2．1臨床觀察：術后兔生命體征平穩(wěn)，手術部位無紅腫、化膿。創(chuàng)口一期愈合。臨床經(jīng)過良好。術后第二日可進食，體重逐漸增加。取標本時可見，各個時期材料在位無移位；1周、4周時材料與骨固定不良，骨和材料間隙可見部分軟組織成分。12周、24周時材料固定良好，間隙內(nèi)軟組織成分消失。40周時材料和骨固定牢固，肉眼見骨和材料直接接觸，無纖維組織長入。各時期空白組均未愈合。

2．2 CT和三維CT：術后6個月、10個月進行CT和三維CT檢查可直觀觀察到：6個月吋材料在位，骨缺損修復完好，材料和骨之間大部分直接接觸，愈合良好，但仍有少部分愈合不良(圖1、2)；10個月時材料完全和骨直接接觸，顱骨外形恢復良好(圖3、4)。

2．2 SEM觀察結果：術后1周，材料和骨愈合不良，在標本制作過程中造成材料和骨的部分分離，材料和骨之間可見到軟組織成分，未見骨成分(圖5)。術后4周，材料和骨結合進一步牢固，但材料和骨之間可見大量軟組織成分存在，局部有新類骨質形成，骨成熟度較低(圖6)。術后12周，材料和骨進一步結合，結合強度增加，纖維性組織仍存在，新類骨質成分增加，缺損局部可見到骨增生突起并和材料相接觸融合(圖7、8)。術后24周，纖維性組織仍有少部分存留，骨性成分更多，骨成熟度較高，材料和骨結合更牢固(圖9、10)。術后40周，軟組織成分消失，材料和骨結合的界面可觀察到直接結合，完全骨愈合，固定牢固，在材料制作過程中未見材料和骨的分離，同時可觀察到骨缺損周圍的骨增生并爬上材料表面，將材料部分包繞，為成熟骨(圖11、12)。

3 討論

動物體內(nèi)骨組織植入實驗是對材料進行功能性的動態(tài)檢查，是反映材料在應用狀態(tài)下的骨組織相容性的主要手段。植入材料與骨缺損邊緣和新骨組織的界面結合形式是衡量該材料性能優(yōu)劣的重要指標。本實驗采用兔顱骨作為研究材料骨組織相容性的動物模型，其原因如下：頭顱骨自身修復能力是全身骨組織中最差的，造成骨缺損不易自行修復，這有利于骨移植替代材料的研究，而且有利于觀察植入材料在骨缺損修復中的作用；顱骨和頜骨胚胎學來源相似，從形態(tài)學來講，顱骨和頜骨都是板狀骨，因此顱骨和頜骨缺損的修復過程是大致相同的。本實驗在兔顱骨制作直徑為1．2cm大小的圓形全層標準骨缺損，排除了骨自行愈合的情況，如血塊機化成骨等因素。實驗中的對照組兔顱骨缺損均未發(fā)生愈合。故本實驗的動物模型用于探討材料的骨缺損修復及骨形成機制具有科學性。

大量的實驗已經(jīng)證明HA具有良好的軟硬組織相容性，可以單獨進行骨缺損的修復或作為組織工程支架材料。殼聚糖是幾丁質部分脫乙酰基也是現(xiàn)今所發(fā)現(xiàn)的唯一帶有正電荷的天然堿性多糖，和軟骨基質糖氨多糖結構相似，具有多個可利用的活性基團，易溶于稀酸，具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且殼聚糖與HA有很強的交互作用，殼聚糖對磷酸八鈣的結晶增長有顯著的影響。所以推測本實驗中應用的豬骨提取的天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料同樣具有良好的骨組織相容性。

通過本實驗證明了天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料具有良好的骨組織相容性。證據(jù)如下：動物實驗術后臨床經(jīng)過良好，切口無紅腫、感染、溢膿，傷口正常愈合，間接證明材料對機體骨組織細胞無毒性，有較好的相容性；CT和三維CT證明本材料對于顱骨缺損有良好的修復；掃描電鏡觀察在術后1、4周時主要是血塊，無菌性炎性組織占據(jù)骨缺損間隙，材料和骨結合弱，在制作標本時材料和骨較易分離；12周、24周時材料和骨結合較強，材料未發(fā)生脫落，同時掃描電鏡發(fā)現(xiàn)骨缺損與材料之間的間隙出現(xiàn)大量的新生骨質，骨質逐漸成熟，部分區(qū)域仍可見膠原成分存在，膠原成熟度逐漸增高；40周時，材料和骨發(fā)生直接的結合，骨組織成熟，周圍的骨質逐漸爬上材料的表面；材料和骨結合的過程符合良好生物相容性材料骨愈合的一般過程。

骨整合是指植入材料和宿主活體骨組織發(fā)生直接結合或功能性結合。最初骨整合僅用于描述鈦牙種植體的生物固定，后來延伸到其他種植材料和骨的結合方式。材料的成分和表面活性決定其和骨結合方式是纖維結合還是骨性結合。材料無毒性，無生物活性，其周圍將形成不同厚度的纖維組織包被；材料無毒性，有生物活性，材料與組織之間將形成界面。在本實驗中，4周到24周均發(fā)現(xiàn)材料周圍發(fā)生新骨形成，新骨逐漸成熟，但是仍有纖維膠原成分存在包裹，并且膠原成分逐漸減少；40周時膠原成分消失，發(fā)生了完全的骨結合。故可以得出本材料無毒性，具有骨組織生物活性，具有良好的骨組織相容性?？梢耘c骨發(fā)生直接的骨性結合。分析發(fā)生骨結合的原因是材料與骨接觸的界面成分為羥基磷灰石和殼聚糖。羥基磷灰石和骨可以發(fā)生直接化學結合，產(chǎn)生骨基質膠原，以后進一步礦化，形成骨組織。隨著時間的推移，殼聚糖刺激磷酸八鈣結晶的增加，和骨交聯(lián)的特性逐漸增加，纖維膠原逐漸發(fā)生鈣鹽沉積，不斷骨化，最終在24周和40周之間實現(xiàn)材料和骨完全結合。

通過本試驗可初步得出天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料具有良好的骨組織相容性，與骨結合界面良好。

編輯／張惠娟

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