人臍血內(nèi)皮祖細胞體內(nèi)促進血管重建的實驗研究

[摘要]目的：通過觀察人臍血內(nèi)皮祖細胞(EPC)在裸鼠體內(nèi)缺氧狀態(tài)下分化成內(nèi)皮細胞的現(xiàn)象，初步研究其促進血管重建的作用。方法：根據(jù)EPC表面標記CDl33，采用免疫磁珠法分離培養(yǎng)EPC。設(shè)計EPC裸鼠成瘤實驗，觀察瘤體內(nèi)血管增生情況；將熒光標記的EPC注射于裸鼠腹部皮辦中，觀察EPC參與皮辦血管重建情況；將EPC接種于聚羥基乙酸(PGA)中，移植于裸鼠皮下，觀察EPC參與血管重建。結(jié)果：原代EPC貼壁后呈梭形，從第7天開始數(shù)量明顯增加，呈克隆狀生長。透射電鏡觀察到成熟內(nèi)皮細胞最具特征性的細胞器——Weibel－—Palade小體。裸鼠成瘤實驗：抗人vWF免疫熒光顯示大量EPC參與腫瘤血管生成；裸鼠皮辦實驗：熒光標記EPC參與裸鼠皮辦血管生成；PGA移植實驗：抗人vWF免疫酶組織化學(xué)染色顯示EPC參與血管生成。結(jié)論：EPC參與血管重建，具有促進血管新生，加速缺血組織血管化的作用。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮祖細胞；CD133(AC133)：免疫磁珠

[中圖分類號]Q254 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01—0015－04

一般認為內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor Cell，EPC)僅見于胚胎時期，但近年來，越來越多的證據(jù)表明在成年個體中也存在少量的EPC。1997年ASahara等報道在成人外周血中分離出EPC，體外培養(yǎng)呈梭形，具有形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力，且能夠表達成熟內(nèi)皮細胞的特異性抗原，在動物實驗中可參與新生血管的形成，此后，又陸續(xù)觀察到骨髓和臍帶血中均存在EPC。EPC具有促進血管新生，加速缺血組織血管化的作用。本實驗采用免疫磁珠法從人臍血中分離培養(yǎng)EPC，觀察EPC在體內(nèi)缺氧條件下分化成內(nèi)皮細胞，并參與血管生成，為治療性血管發(fā)生研究及組織器官移植提供種子細胞。

1 材料和方法

1．1主要試劑及標本來源：胃癌GC7901細胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究中心細胞庫提供)；ACD—B抗凝液(上海市血液中心)：1．077淋巴細胞分離液(天津TBD公司)；免疫磁珠試劑盒(挪威DYNAL公司)；Fibronectin(美國Sigma公司)：異硫氰酸熒光素(FITC)CDl33單抗(美國RD公司)；抗人vWF單抗(英國Serotec公司)；F1RC－二抗及辣根過氧化物酶標記二抗、CD34單抗(丹麥DAKO公司)；EGM-2MV培養(yǎng)基(美國Cambrex公司)；細胞熒光染色試劑盒(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit，Sigma，美國)；人纖維蛋白原(Fibronogen，Sigma，美國)：人凝血酶(Thrombin 500，IMMUNO AG，奧地利)：PGA真皮替代物(NEOVEIL，日本)。BALB／c，nu／lnu裸小鼠15只，雌雄不限，鼠齡4～6周，體重18～23g(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物研究中心)；人臍血標本來源于本院34例婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦(產(chǎn)婦均知情同意)。

1．2 EPC分離及誘導(dǎo)分化培養(yǎng)：ACD-B抗凝臍血，1：2加入磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，取7ml緩慢加入3ml淋巴細胞分離液，621×g離心30min，取單個核細胞層，PBS洗滌3次去血小板。免疫磁珠與FITC-CDl33單抗室溫孵育30min，PBS洗去多余單抗。將包被FITC-CD133的免疫磁珠加入單個核細胞中，室溫孵育30min，置于磁場中1min，棄細胞懸液，參照免疫磁珠試劑盒說明書分離出CD133⁺細胞。加入EGM-2MV培養(yǎng)基(hEGF，Hydrocortisone，VEGF，F(xiàn)GF-B，R3－IGF－1)，接種于包被Fibronectin的25cm²培養(yǎng)瓶中，37℃，飽和濕度培養(yǎng)。24h換液除去未貼壁細胞，3天后半量換液，培養(yǎng)3～4周。檢測指標：①原代EPC的生長曲線：細胞以5×10³個／孔的密度接種于96孔板。1～19天，隔日隨機抽取4個培養(yǎng)孔，噻唑藍(MTT)法測定各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線。設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液為空白對照。②CDl33^＋細胞分化：培養(yǎng)5天、10天的細胞分別加入FITC-CDl33單抗、CD34單抗、vWF單抗，室溫孵育30min，PBS洗去多余單抗。加入辣根過氧化物酶標記二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；取培養(yǎng)10天的細胞。③行透射電鏡觀察找Weibel-Palade小體。

1．3裸鼠成瘤實驗：常規(guī)方法復(fù)蘇、培養(yǎng)將胃癌GC7901細胞。取1×10⁶個／1001×1原代培養(yǎng)EPC與1×10⁶個／100μl胃癌GC7901細胞混合接種于裸鼠背部皮下。30天過量麻藥腹腔注射處死裸鼠，取出腫瘤。40g／L多聚甲醛固定12h，常規(guī)石蠟切片vWF免疫組化染色。觀察瘤體內(nèi)EPC參與構(gòu)成血管情況。

1．4裸鼠皮辦實驗：取5×10⁶EPC，90g(800rpm)，離心5min棄上清，加入稀釋液(Diluent C)0．5ml，重懸取1μl PKH26熒光染液，迅速加入細胞懸液中室溫孵育2～5min。加入1ml RPM11640／10％FBS培養(yǎng)基中止染色，調(diào)整細胞濃度為1×10⁶／ml，熒光顯微鏡下觀察。采用0．3％戊巴比妥鈉腹腔麻醉。裸鼠腹腔注射0．5～0．7ml，3～5min麻醉生效后，根據(jù)設(shè)計于腹部肉膜層與深筋膜的淺面之間，將皮瓣仔細掀起，熒光標記EPC單細胞懸液100μl(1×10⁵)，分成3點(遠點、中點、蒂部)經(jīng)皮辦軟組織面均勻皮下注射于皮瓣。術(shù)后7天，過量麻藥腹腔注射處死裸鼠，于皮辦中段切取組織，大小1．0cm×0．5cm。①細胞示蹤：行冰凍切片，采用570nm波長，熒光顯微鏡觀察。②常規(guī)石蠟切片vWF免疫組化染色，觀察EPC參與構(gòu)成血管情況。

1．5取對數(shù)生長期EPC及成纖維細胞與纖維蛋白原溶液(5g/L)按1：2：3混合，加入PGA材料(預(yù)先加入20u／40μl凝血酶)，37℃放置10min，混懸液便形成凝膠狀固定于網(wǎng)孔中，加入EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，移植于裸鼠背部皮下。于裸鼠移植后21天取材，4％多聚甲醛固定。常規(guī)石蠟切片，vWF免疫酶組織化學(xué)染色，鏡檢。

2 結(jié)果

2．1 EPC傳代培養(yǎng)后，細胞形態(tài)及密度均勻，前3天為相對抑制期，此后呈指數(shù)形式快速增殖，10天后達到80％～90％融合。EPC生長曲線(圖1)顯示：人臍血EPC接種后5天內(nèi)細胞數(shù)量無明顯增加，從第7天開始細胞數(shù)量明顯增加，在第16天達到最高峰，以后增殖趨于平緩。

2．2原代EPC貼壁緩慢，24h后懸浮細胞重新接種培養(yǎng)仍有細胞貼壁生長。EPC在Fibronectin包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，可見到部分圓形大單核細胞粘附于培養(yǎng)瓶底，3天后細胞貼壁完全，少量細胞開始伸展，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的延長，圓形細胞逐漸減少，梭形細胞數(shù)量逐漸增多。7天左右出現(xiàn)由十數(shù)個細胞形成的細胞集落，可見20～30或更多數(shù)目細胞排列成內(nèi)皮細胞特異性條索狀結(jié)構(gòu)或網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。10天后形成明顯克隆，并有梭形貼壁細胞從其邊緣不斷生成，2～3周，細胞長滿培養(yǎng)瓶底，單層細胞呈多角形融合成片狀(圖2)。

2．3原代培養(yǎng)第10天細胞透射電鏡顯示：人臍血EPC平均直徑15μm，核／漿比例大。細胞膜伸出許多偽足絲，基底膜呈多層。胞漿內(nèi)可見一種短棒狀小體，含平行管狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即Weibel-Palade小體(圖3)，是內(nèi)皮細胞最具特征性的細胞器。

2．4 5只裸鼠接種細胞7天后均見腫瘤快速生長，抗人vWF免疫熒光組織化學(xué)染色顯示大量EPC參與腫瘤血管構(gòu)建(圖4)。

2．5 EPC參與皮辦血管重建的觀察：通過實驗室體外培養(yǎng)，證實染色后細胞增殖活性無明顯變化，在熒光顯微鏡下可以清楚地辨別細胞的輪廓，染料在細胞膜上分布均勻一致。通過移植后7天皮瓣中段真皮下層熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)皮辦真皮下層存在能激發(fā)出紅色熒光的細胞，多呈散在分布，或呈條索狀分布(圖5)，偶可見管狀結(jié)構(gòu)。并通過抗人vWF免疫酶組織化學(xué)染色，進一步證實EPC確實參與皮辦血管重建(圖6)。

2．6 EPC、成纖維細胞與纖維蛋白原混懸液與凝血酶混合后，數(shù)秒鐘后即形成膠凍狀，數(shù)小時后可見細胞均勻分布于真皮支架的各個層面，并逐漸伸展為梭形或多極狀，貼附于PGA支架纖維材料上(圖7)，隨培養(yǎng)時間的延長，細胞呈簇狀聚集生長。移植21天，真皮替代物支架中的孔隙已完全被細胞和細胞外間質(zhì)填充，支架部分降解，被大量平行排列的新生膠原纖維所替代，可見大量新生小血管形成，vWF免疫酶組織化學(xué)染色陽性(圖8)，表明種植的EPC具有生物學(xué)活性，參與血管化過程。

3 討論

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)是一類能循環(huán)、增殖并能直接分化為血管內(nèi)皮細胞(endothelial cells，EC)，但尚未表達成熟血管內(nèi)皮細胞表型的前體細胞。以前認為EPC僅僅出現(xiàn)于胚胎血管發(fā)育階段，在人出生后，并不存在EPC。但最近研究發(fā)現(xiàn)在臍帶血、成人外周血、骨髓中的CD34^＋細胞或flk 1⁺細胞或CD133+³細胞離體培養(yǎng)兩周后均能分化為內(nèi)皮細胞，從而證實成年個體中存在EPCI3-41。并且經(jīng)異體骨髓移植模型證實，成年個體外周血中的EPC來源于骨髓，在受到血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、粒細胞／巨噬細胞集落刺激因子(G／M-CSF)等細胞因子以及缺氧刺激后可加速動員入外周血。在動物后肢缺血模型及大鼠急性心肌梗死模型中，人外周血、臍帶血和骨髓來源的EPC移植均取得了很好的療效。為臨床缺血性疾病的血運重建提供了一種新的治療策略。

目前對EPC發(fā)育分化的機制尚不十分清楚。EPC從原血干細胞而來，定向分化為內(nèi)皮細胞，在此分化發(fā)育過程中，flk1是最先表達的內(nèi)皮標志，其次是PECAM和Tie2的表達。成人外周血中的CD34⁺／ACl33⁺／flkl⁺EPC體外培養(yǎng)分化為成熟內(nèi)皮細胞過程中，干細胞標志ACl33⁺逐漸下降，2周后完全消失，表明EPC是從原血干細胞到內(nèi)皮細胞過程中的一個過渡的轉(zhuǎn)瞬即逝的細胞表型階段，隨著系列定向和分化成熟，在某些基因的調(diào)控下，細胞表型逐漸改變。目前尚未發(fā)現(xiàn)EPC的特異性表面標記物，CD133是新近發(fā)現(xiàn)的干細胞標記，其表達在造血干／祖細胞分化過程中迅速下調(diào)，而不表達于CD34^-群體。更重要的是CD34⁺／VEGFR-2⁺的細胞均表達CD133，這就使CD133成為富集EPC的理想細胞標記。

本實驗采用免疫磁珠法從人臍血中分離培養(yǎng)CDl33⁺血管內(nèi)皮祖細胞，通過CD133、CD34、vWF以及透射電鏡對不同時期的細胞進行鑒定，證明此CD133⁺血管內(nèi)皮祖細胞具有分化為成熟血管內(nèi)皮細胞的能力。并通過裸鼠成瘤實驗、皮辦實驗及PGA移植實驗證明EPC參與生成，具有促進血管新生，加速缺血組織血管化的作用。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。