不同方法分離的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性和成脂分化能力的比較

肖 斌

[摘要]目的：通過比較密度梯度離心和貼壁篩選兩種方法所獲MSCs的增殖活性和成脂分化能力，探索MSCs體外分離和純化的較好方法。方法：應(yīng)用密度梯度離心和貼壁篩選兩種方法分離純化骨髓MSCs，并通過MTT法檢測其增殖活性，用第三代MSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，以觀察兩種方法所獲MSCs的成脂分化能力。結(jié)果：密度梯度離心法所獲MSCs純度高，呈紡綞形或小三角形，增殖快，約7～10天融合：貼壁篩選法分離的原代細(xì)胞中紅細(xì)胞。破骨細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞較多，增殖速度相對較慢，且經(jīng)數(shù)次傳代仍有較多雜質(zhì)細(xì)胞存在，經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，兩種方法所獲MSCs表現(xiàn)出相似的成脂能力，油紅O染色細(xì)胞計數(shù)值與光密度值比較兩組無顯著差異(P值>0．05)。結(jié)論：密度梯度離心法是體外分離和純化MSCs較好的方法，所獲細(xì)胞增殖活性高，與貼壁篩選法所獲MSCs具有相似的成脂分化能力。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；成脂分化；組織工程

[中圖分類號]Q2－06 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)01－0021－04

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchy mal stem cell，MSCs)具有來源廣泛，容易獲取，創(chuàng)傷小，無免疫排斥反應(yīng)，細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，增殖能力強(qiáng)，易于培養(yǎng)和自體移植，不存在倫理、道德和法律爭議問題，克服了胚胎干細(xì)胞的弊端，其所具有的獨(dú)特優(yōu)勢在組織工程研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。MSCs可以直接從自體骨髓腔抽吸或松質(zhì)骨獲得，可作為組織工程中構(gòu)建組織的種子細(xì)胞。MSCs常用的分離方法有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法。由于流式細(xì)胞儀分選法步驟比較繁瑣，現(xiàn)在分離MSCs最常用的方法是貼壁篩選法和密度梯度離心法。本研究采用密度梯度離心法和貼壁法分離MSCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過比較所獲得MSCs的細(xì)胞純度、增殖活力及成脂能力，以尋求一種較為理想的體外分離、純化與培養(yǎng)MSCs的方法。

1 材料和方法

1．1材料：實(shí)驗(yàn)動物為體重(100+20)g的2月齡雄性SD大鼠(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物科)。MEM(Gibco BRL公司)，胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，IBMX(Sigma公司)，CO₂恒溫培養(yǎng)箱(Heracell，德國)，超凈工作臺(杭州凈化有限公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)。

1．2方法

1．2．1大鼠MSCs的分離、純化1．2．1．1貼壁法：將SD大鼠拉頸處死，75％酒精浸泡15～20min，無菌條件下取脛骨和股骨，將其兩端干骺端切除，顯露骨髓腔，用含10％FBS的MEM徹底沖洗骨髓腔，無菌注射器反復(fù)吹打沖出的骨髓，使骨髓細(xì)胞充分分散制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，按2×10⁹／cm²密度置于培養(yǎng)皿中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．1．2密度梯度離心法：取骨髓方法同上，將所獲骨髓單細(xì)胞懸液800×g離心5min，去除上部的脂肪層，將余下部分加入含有1．073g/ml的percoll分離液中2500×g離心25mim；吸取中間層的單個核細(xì)胞，用培養(yǎng)基MEM洗滌2次，重新懸起細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度后，按2×10⁹／cm²，置于培養(yǎng)皿中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．2細(xì)胞傳代：細(xì)胞長至70％～80％融合時，以0．25％的胰蛋白酶消化，1×105／cm2密度進(jìn)行接種。1．2。3增殖特性：取第1代細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)0．25％胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，按1×10⁵細(xì)胞／孔接種于96孔板。從接種后第1天起分別于第1．3．5．7．9．11天取6個時間點(diǎn)用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。用酶標(biāo)儀在630nm波長下檢測每孔的光吸收值(OD)，并繪制生長曲線。

1．2．4定向誘導(dǎo)大鼠MSCs向脂肪細(xì)胞分化：細(xì)胞接近完全融合后，加入含1μmol／L的地塞米松，0．5mmol／L的IBMX，1μmol／ml的人胰島素，1μmol／ml吲哚美辛，10％FBS的MEM(誘導(dǎo)培養(yǎng)液)培養(yǎng)3～4天換液。

1．2．5特異性脂肪細(xì)胞染色鑒定：爬片細(xì)胞用PBS沖洗2遍，10％福爾馬林固定30 min，60％異丙醇固定30min，油紅O染液1h，60％異丙醇固定30min，蒸餾水沖洗棄液，顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)記數(shù)10個非重復(fù)視野內(nèi)脂肪細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。

1．2．6油紅O染色定量：將P3代長至接近完全融合后加入含脂肪誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，第14天油紅O染色(方法同上)后用蒸餾水沖洗后吹干，各培養(yǎng)皿加入同等量的異丙醇，充分震蕩搖勻后，將液體離心取上清放入比色杯中進(jìn)行光吸收值測定，通過光密度值推斷脂肪細(xì)胞的數(shù)量。

1．2．7數(shù)據(jù)統(tǒng)計：所有數(shù)據(jù)均用x±s表示。使用SPSS11．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組(密度梯度法組與貼壁法組)之間的比較用t檢驗(yàn)，P值＜0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1原代和傳代培養(yǎng)的大鼠MSCs的形態(tài)學(xué)觀察

2．2．1貼壁法所獲得的原代MSCs：于細(xì)胞生長至第3天可見貼壁細(xì)胞形態(tài)各異，并夾雜大量的紅細(xì)胞：經(jīng)第一次換液后，細(xì)胞增殖加快，其增殖速度明顯快于密度梯度離心法。約第6天細(xì)胞達(dá)70％～80％融合，并形成多種細(xì)胞形態(tài)的增殖集落。細(xì)胞以多角和長梭形為主，并有較多的細(xì)胞呈圓形及其它不規(guī)則形態(tài)，并帶有樹枝狀突起，其間也可見許多紅細(xì)胞以及形體較大、含有多個核的破骨樣和巨嗜細(xì)胞樣細(xì)胞。經(jīng)2～3次傳代后細(xì)胞以長梭形和三角形的為主(見圖1)。

2．2．2密度梯度離心法所獲原代MSCs：于細(xì)胞生長第3天時，可見許多貼壁細(xì)胞，并均勻分散生長；細(xì)胞以小三角形、梭形貼壁生長，胞核位于中央，其間夾雜少量有核的淋巴細(xì)胞，紅細(xì)胞極少見。第一次換液培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖迅速，圓形貼壁細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，梭形細(xì)胞的分裂速度明顯較快，在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢，培養(yǎng)5～7天后，培養(yǎng)細(xì)胞開始迅速增殖，細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)較大變化，可見紡綞形和星形多突起的細(xì)胞貼壁生長。10～14天時，細(xì)胞已達(dá)到70％～80％融合，進(jìn)行傳代。傳代后的細(xì)胞增殖活力強(qiáng)，形成均一的長梭形、多角形細(xì)胞，一般培養(yǎng)5～8天，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合，再次進(jìn)行傳代(見圖2)。

2．3 MSCs的生長曲線：兩組細(xì)胞MTT檢測顯示：密度梯度離心法所獲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞子第1天OD值較高：從第3天起細(xì)胞迅速增殖，進(jìn)入指數(shù)增長期；第7天起增殖速度明顯減慢，進(jìn)入平臺期；而貼壁法所獲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第1天OD值明顯低于密度梯度離心法：細(xì)胞從第3天起增殖加快，進(jìn)入指數(shù)增長期，增殖速度低于前一組：至第9天，細(xì)胞增殖明顯減慢進(jìn)入下臺期(見圖3)

2．4大鼠MSCs定向誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞：兩種方法所分離的細(xì)胞加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液后，第3天在相差顯微鏡下可觀察到細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有高折光性的小脂滴出現(xiàn)主要集中于細(xì)胞核周圍，隨著誘導(dǎo)時間的延長細(xì)胞內(nèi)脂滴逐漸增多，胞內(nèi)小脂滴逐漸聚集成大脂滴，細(xì)胞體積逐漸增大由原來的長梭形變?yōu)閳A形或多角形，脂肪細(xì)胞中含大小不等的脂肪滴，脂滴被染成橙紅色證實(shí)誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞，而未誘導(dǎo)的對照組細(xì)胞則表現(xiàn)為陰性(見圖4、5)。每組隨機(jī)選取5枚蓋玻片，對兩種方法所獲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞做油紅O染色后的脂肪細(xì)胞計數(shù)比較，結(jié)果密度梯度離心法和貼壁法的均值分別為(62．73±2．92)和(59．63±4．53)，經(jīng)t檢驗(yàn)顯示兩組細(xì)胞之間無顯著差異(P=1．39＞>0．05)。

2．5油紅O染色定量試驗(yàn)：對兩種方法所獲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞做油紅O染色光密度值測定比較，結(jié)果密度梯度離心法和貼壁法的均值分別為(0．28±0．14)和(1．01±0．99)，經(jīng)t檢驗(yàn)顯示兩組之間無顯著差異(P=0．191＞0．05)。

3 討論

1986年Friedenstein等首次報道，骨髓標(biāo)本中的小部分貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能夠分化成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞，而且這些細(xì)胞經(jīng)過20～30個培養(yǎng)周期仍能保持其多向分化潛能，這類細(xì)胞被稱之為MSCs。

MSCs內(nèi)存在有幾套可以向幾種終未細(xì)胞分化的儲備基因，當(dāng)某種因素在一定條件下對它進(jìn)行作用時，就會誘導(dǎo)相應(yīng)系列基因的表達(dá)，使細(xì)胞向這一方向分化。不同的研究者根據(jù)各自的結(jié)果，提出了不同的假說，伴隨著人們對MSCs更深入的研究與認(rèn)識，MSCs的多向分化機(jī)制會逐漸被人們所了解。Lee等證實(shí)MSCs是脂肪移植較好的細(xì)胞來源。MSCs具有多向分化潛能，易誘導(dǎo)為成熟細(xì)胞，來源豐富，可塑性強(qiáng)等特點(diǎn)。最大特色是可實(shí)現(xiàn)個體化治療，可以冷凍保存，方便臨床使用，無免疫排斥問題，但是MSCs只占整個骨髓中有核細(xì)胞的十萬分之一，并隨年齡的增加而減少，同時骨髓還含有其它多種細(xì)胞成分，因此至今尚無一個理想的獲取較高純度MSCs的分離、純化及體外擴(kuò)增方案。

本研究對密度梯度離心及貼壁篩選法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度及增殖特性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)貼壁法雖然簡單，但所獲細(xì)胞成分復(fù)雜，細(xì)胞純度不足，其中可見許多紅細(xì)胞以及形體較大、含有多個核的破骨樣和巨嗜細(xì)胞樣細(xì)胞。經(jīng)多次傳代仍可見較多雜質(zhì)細(xì)胞存在，且增殖活力相對較低，對細(xì)胞純度要求較高的組織工程來說作為種子細(xì)胞并不是很理想。密度梯度離心法分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雜質(zhì)細(xì)胞少，細(xì)胞活力強(qiáng)，增殖速度快，原代細(xì)胞可形成均一的增殖集落，并能穩(wěn)定傳代，保持其多項(xiàng)分化潛能的特性。該結(jié)果與多數(shù)文獻(xiàn)相一致，說明密度梯度離心法是目前分離純化MSCs的較好方法。

油紅O染色是檢測脂肪細(xì)胞的特異性方法，而MSCs要作為脂肪組織工程的種子細(xì)胞，首先要分化成脂肪細(xì)胞。在本研究中通過應(yīng)用地塞米松，IBMX，人胰島素，吲哚美辛誘導(dǎo)，兩種方法獲得的MSCs于誘導(dǎo)14天后，油紅O染色多數(shù)細(xì)胞均呈陽性，而未誘導(dǎo)的對照組均表現(xiàn)為陰性。兩種方法所獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所形成的脂滴數(shù)量經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異，說明兩種方法所分離的細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)條件下向成脂肪分化的能力是相似的。

綜上所述，密度梯度離心法是體外分離、純化MSCs的良好方法，應(yīng)用此方法分離純化MSCs可用于組織工程學(xué)研究。

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。