Ｐ物質緩釋系統(tǒng)對正畸大鼠牙周破骨細胞數(shù)目的影響

[摘要]目的：探討P物質納米緩釋微球的生物活性及對正畸牙周改建中破骨細胞數(shù)目變化的影響。方法：將P物質一聚乳酸一聚乙醇酸共聚物納米緩釋微球(sP—PLGA NP)注射入正畸大鼠第一磨牙根尖水平齦下，分別在加力后1，3，7，14天后采用HE染色觀察牙周組織變化和壓力側破骨細胞數(shù)目，并和單純用P物質以及空白對照組比較。結果：加力后1天，三組間牙周都未發(fā)現(xiàn)有破骨細胞；加后3天，破骨細胞數(shù)量表現(xiàn)為P物質組>緩釋納米微球組>對照組，與對照組有顯著性差異(P<0．05)；加力后7天，表現(xiàn)為緩釋納米微球組>P物質組>對照組，與對照組有顯著性差異(P<0．05)；加力14天后，三組破骨細胞數(shù)量都有減少，但緩釋納米微球細數(shù)量最多。結論：P物質能促進嘶中牙周破骨細胞形戍，而sP—PLGA NP能在較長時間維持這種作用。

[關鍵詞]P物質；聚乳酸一聚乙醇酸共聚物；納米微球；破骨細胞；牙齒移動

[中圖分類號]R813．1．1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)02-0153-03

P物質在正畸組織改建中發(fā)揮重要的作用，但其在體內半衰期短，很快會被機體降解，不利于觀察它的作用。為了能在動物體內較長時間觀察P物質的作用，我們選擇聚乳酸一聚乙醇酸共聚物(poly lactide—co-glyc01ide，PLGA)為載體材料，應用復乳干燥法制備了P物質納米微球。本試驗采用給正畸大鼠注射P物質緩釋納米微球，并與單純使用P物質以及空白對照組比較，觀察P物質納米緩釋微球的生物活性情況以及對牙周壓力側破骨細胞數(shù)目的影響。

1材料和方法

1．1實驗動物及分組：6周齡SD雄性大鼠48只，體重：(180±20)g，解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，飼料為本校實驗動物中心提供的普通塊料。避光靜養(yǎng)48h后進行實驗。第l組：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙齦下注射含5×10—3rng P物質的sP—PLGA NP的PBS溶液100ul(緩釋納米微球組)；第2組：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙齦下注射含5×10^-1mgP物質的PBs 100ul(P物質組)；第3組：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙齦下注射100ul的PBs(對照組)。每一組中分四個亞組：加力l天組、3天組、7天組、14天組。每一亞組4只大鼠。1．2主要試劑與儀器：人P物質(substance P)(Sigma公司，USA)；自制P物質納米粒及其凍干粉劑(圖1)；速眠新(長春軍需大學獸醫(yī)研究所)；細金剛砂鉆(登士柏公司)；正畸測力計(精確到1g，Swi ss)；正畸用螺旋彈簧(杭州新亞公司)；OLYMPUS數(shù)字顯微鏡(JaparO；JEM-2000EX透射電鏡qaparO。1．3動物模型及標本制備：SD雄性大鼠，體重(180±20)g(7～9周)。加力裝置采用結扎絲將一根鎳鈦螺旋拉簧一端扎在上頜第一磨牙上，另一端結扎在上頜中切牙上，并用自凝塑料加固結扎絲與牙連接處。加力值為50g，使磨牙向近中移動。分別在各組時間點將各亞組大鼠處死取材：速眠新深麻，開胸經左心室插管至升主動脈進行灌注固定，先用80～lOOml生理鹽水將血管內的血液沖洗干凈，再注入含4％多聚甲醛的固定液400ml灌流內固定1．5h，由口腔內切開上頜骨周圍軟組織，剪斷雙側顴突，取出上頜骨，修剪后置于4％多聚甲醛液中固定4天，然后置于由甲醛、甲酸和鹽酸組成的脫鈣液中脫鈣10天。將脫鈣的上頜骨去除多余組織，保留磨牙，入30％蔗糖24h 4℃至組織沉底。常規(guī)石蠟包埋后，沿近遠中方向縱行切片，片厚5um。1．4 HE染色，觀察結果：切片進行HE染色：蘇木素浸染lOmin，清水沖洗，入鹽酸1s，沖洗，稀氨水30s，沖洗，伊紅lmin，75％～100％梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每個標本取包含根尖周的切片二三張，每張切片在×40顯微鏡下觀察壓力側牙周近根尖處組織，計數(shù)單個視野內破骨細胞數(shù)量(三核以上為納入標準)。

1．5統(tǒng)計學處理：測量所得數(shù)據(jù)以x±s表示，結果用SPSS 11．0作統(tǒng)計學分析。多組均數(shù)問差異性比較用方差分析(F檢驗)，三組問兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0．05為差異有顯著性。

2結果

2．1P物質納米球膠體溶液混懸透明。在電鏡下，該納米球表面光滑圓整，球體均勻度好，粒徑分布較均勻，平均粒徑(22．32±5．41)nm，見圖l。凍干粉劑為白色疏松粉末，無塌陷或萎縮現(xiàn)象。4℃下放置3個月后，凍干粉再分散性良好，在生理鹽水中均勻分布呈乳狀液，無沉淀，表明納米粒穩(wěn)定性及再分散性良好。P物質納米球的載藥量為(32．08±1．67)×10。。(g／g)，包封率為(66．28±3。56)％。該納米微球在12天內能夠一直持續(xù)釋放P物質，突釋期內P物質釋放度為25．64％，12天后釋放度為77．46％。2．2組織切片顯示：加力后1天，壓力側牙周間隙縮窄，牙周膜中有形成份減少，可見無細胞區(qū)的玻璃樣變，未見破骨細胞；加力3天后，壓力側牙周組織玻璃樣變性區(qū)增大，牙周膜纖維開始出現(xiàn)破壞，鄰近的骨吸收陷窩增大，增深，可見有破骨細胞(圖2)；加力7天后壓力側透明樣變性區(qū)縮小，牙槽骨呈鋸齒狀吸收陷窩，內可見較多的破骨細胞(圖3)；加力14天后壓力側牙槽骨吸收仍然明顯，骨表面陷窩內有破骨細胞存在，但“鋸齒”顯著變小(圖4)。加力后1天，三組間牙周都未發(fā)現(xiàn)有破骨細胞；加力后3天，破骨細胞數(shù)量明顯增加，并且P物質組>緩釋納米微球組>對照組(P<0．05)；加力后7天，破骨細胞數(shù)量繼續(xù)增多，緩釋納米微球組>P物質組>對照組(P<0．05)；加力14天后，三組破骨細胞數(shù)量都有減少，但緩釋納米微球組數(shù)量最多，多于其它兩組，但均和對照組問則無統(tǒng)計學差異。該結果提示我們所制備的SP-PLGA NP能緩慢釋放活性物質，同時也表明P物質能促進局部破骨細胞形成。

3討論

P物質是一種由11個氨基酸組成的多肽易被酶水解，在體內半衰期僅有幾分鐘，導致其局部或全身應用的生物利用度低。為此，本研究制備了P物質納米微粒，能夠持續(xù)釋放P物質，并維持在有效生理濃度內，以利于在較長時間觀察它的作用。我們是以PLGA為載體材料，采用了單因素正交設計優(yōu)化P物質納米微粒制備工藝。應用PLGA包封P物質，既可以起到緩釋作用，又可以利用材料的疏水性保護因子活性。PLGA是PLA(聚乳酸)和PGA(聚乙醇酸)的共聚物。由于其具有易于合成、質量穩(wěn)定，生物惰性、生物可降解性、降解速度可調節(jié)性和良好的可塑性等優(yōu)點，近些年來被大量用作控釋系統(tǒng)的骨架材料。實驗證明PLGA具有良好的生物相容性，不會引起明顯炎性反應、免疫反應和細胞毒性反應。PLGA也是美國FDA批準最早的可用于人體的高分子載藥材料。目前對于親水性藥物以PLGA為載體制備載藥微球一般用復乳溶劑揮發(fā)法。復乳法主要用于親水性藥物，例如蛋白質、疫苗等。P物質易溶于水，溶解度為lmg／m1。所以我們在選擇制備方法時，采用了復乳法。所制備的SP—PLGA納米微球球體均勻度好，凍干粉為白色疏松粉末，再分散性良好。

P物質在骨質改建中具有促進骨吸收的功效。Goto等通過大鼠顱骨實驗研究發(fā)現(xiàn)，極微量的sP就可使顱骨的骨吸收增加。此外，在培養(yǎng)的家兔破骨細胞中加入sP可使破骨細胞內的鈣離子濃度增加，從而使破骨細胞的骨吸收活動增加。這種現(xiàn)象可被SP受體的阻斷劑所阻斷。這些試驗表明SP可加速破骨細胞的骨吸收及促進骨的重建。交感神經切除后可引起局部SP釋放增加、破骨細胞數(shù)量增多及骨吸收表面積擴大。Goto等進一步研究表明，NKl受體廣泛分布于破骨細胞的胞膜及胞漿中，而在成骨細胞和其他骨細胞中較少，雖然尚沒有直接證據(jù)表明SP具有刺激骨吸收的作用，但SP可能通過NKl來調節(jié)破骨細胞的骨吸收作用。

sP樣神經纖維與正畸牙周組織的改建關系密切。Davidovitch等觀察了在貓上頜尖牙向遠中傾斜移動過程中的P物質反應，發(fā)現(xiàn)加力后1hP物質免疫反應就開始增強，尤其在張力區(qū)，這種染色增加的現(xiàn)象一直持續(xù)到12h，但到24h，其染色密度下降到對照組水平，且一直持續(xù)到14天。Norevall等觀察了大鼠上頜第一磨牙向頰側移動過程中的P物質反應，該實驗不僅觀察了加力階段而且還包括撤力后牙周組織修復階段。發(fā)現(xiàn)加力后24h或3天，P物質免疫反應明顯增強；撤力后14天P物質免疫反應仍然很強；撤力后28天P物質免疫染色強度開始下降，但仍明顯高于對照組。有學者推測在正畸牙齒移動過程中，機械刺激導致感覺神經末梢向牙周組織內釋放神經介質SP、降鈣素基因相關肽等，進一步激活牙周靶細胞(包括成骨細胞、破骨細胞、牙周膜成纖維細胞等)，從而影響這些細胞的生理功能，參與牙周組織的改建。

本研究發(fā)現(xiàn)：加力后1天，三組問牙周都未發(fā)現(xiàn)有破骨細胞；加力后3天，破骨細胞數(shù)量表現(xiàn)為P物質組>緩釋納米微球組>對照組；加力后7天，表現(xiàn)為緩釋納米微球組>P物質組>對照組；加力14天后，三組破骨細胞數(shù)量都有減少，但緩釋納米微球組數(shù)量最多，多于其他兩組，P物質組和對照組則無統(tǒng)計學差別，但P物質組絕對值要高于對照組。該結果證明了我們所制備的SP-PLGA NP能緩慢釋放活性P物質，同時也表明P物質能促進正畸牙周局部破骨細胞形成。結果也提示SP～PLGA NP可能在加速正畸骨改建中發(fā)揮作用，并需要進一步的研究證實。

編輯／張惠娟

(注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。)