串珠素在大鼠牙胚發(fā)育過程中的表達和意義

[摘要]目的：觀察牙胚發(fā)育不同時期串珠素(Perlecan)的分布與表達情況，探討其與牙胚發(fā)育的關系。方法：出生0天、1天、1周、2周的SD大鼠取下頜第一磨牙，行Perlecan免疫組化染色(SABC法)，光鏡觀察其表達與分布情況。結果：Perlecan在大鼠各時間段牙胚均有陽性表達，但各時期的分布模式不同，出生后各時間段，成釉器中均為強陽性表達，而牙囊中Perlecan表達隨著牙胚發(fā)育而不斷增強，之后又隨著牙胚的成熟而下降。結論：Perlecan可能在牙胚的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。

[關鍵詞]串珠素；牙囊；免疫組化；牙胚

[中圖分類號]R781 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)03－0305－02

牙齒的發(fā)育是一個復雜的過程，其間要經(jīng)過牙胚的發(fā)生、形態(tài)形成、特異細胞的分化、特異組織的形成和成熟、牙齒的萌出等過程。串珠素是細胞外基質中的主要蛋白聚糖之一，由核心蛋白和4條硫酸肝素(heperin sulfate，HS)側鏈組成，分子量約為700kD。其可以作為一種穩(wěn)定基質結構和細胞—基質相互作用的粘合劑，并能介導生長因子信號對細胞增殖和分化起作用。研究表明，串珠素基因在心血管和軟骨的發(fā)育過程中起著非常重要的作用。近年來，隨著牙齒組織工程技術的不斷發(fā)展，牙胚的發(fā)育機制已受到國內外眾多學科學者的關注。本文通過觀察Perlecan在牙胚發(fā)育不同時期的表達，為探討其在牙胚發(fā)育過程中的相關機制提供實驗理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 標本來源：SD大鼠，一級，40只，出生0天、1天、1周、2周各10只，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，編號SCXK(軍)2002－005，雌雄各半。

1．2 主要試劑及儀器：Olympus顯微鏡，Perlecan單克隆抗體為大鼠IgG(美國CHEMICOM公司)，兔抗大鼠IgG及SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(北京中山生物技術公司)。

1．3 實驗方法(標本制備)：用10g/L戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉后，分別把出生0天、1天、1周，2周各時間段大鼠的下頜第一磨牙連同下頜骨一起取下，在40g/L多聚甲醛液中固定24h。用8mol/L甲酸和1mol/L甲酸鈉等量混合的脫鈣液中脫鈣1周，期間每天換一次脫鈣液。然后流水沖24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，石蠟切片機制作矢狀、4μm厚石蠟切片。

1．4 實驗步驟：將石蠟切片分別放在梯度酒精中脫蠟至水。新鮮配置的3％雙氧水室溫10min以滅活內源性酶。蒸餾水沖洗3次，每次2min。修復抗原：將切片侵入0.01ml，ph6.0的檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐加熱，經(jīng)沸騰—冷卻—沸騰—冷卻這樣循環(huán)2次。蒸餾水沖洗3次，每次2min。滴加一抗大鼠IgO，4℃過夜。0.01MPBS洗3次，每次5min。滴加二抗(羊抗鼠IgG)，室溫下放3h，0.01MPBS洗3次，每次5min。顯色。替代對照，免疫前的正常血清替代一抗，空白對照，PBS代替一抗。陽性染色為棕黃色。

2 結果

出生后0天，成釉器與牙乳頭間的基底膜、內釉和外釉上皮呈強陽性表達，牙囊組織有陽性信號，牙乳頭為弱陽性。出生1天，成釉器進一步發(fā)育，釉結節(jié)開始形成，釉結節(jié)上皮細胞、基底膜強陽性表達，外釉、內釉、牙囊、牙乳頭均有陽性表達。出生1周，內釉上皮細胞開始分化成成釉細胞，牙本質細胞尚未形成，內釉、外釉上皮強陽性表達，牙囊、牙乳頭呈陽性表達。出生后2周，釉基質、牙本質已形成，牙本質表面可見斑點狀的釉質形成，外釉上皮細胞、星網(wǎng)層已失去其獨立性，所形成的多層細胞層與成釉細胞緊密相連；牙釉質成強陽性表達，牙乳頭、外周上皮細胞層呈陽性表達；而上述陽性表達區(qū)主要分布在細胞周圍的基質中。

3 討論

perlecan作為一種穩(wěn)定基質結構和細胞一基質相互作用的粘合劑，并能介導生長因子信號對細胞增生和分化的作用。用重組蛋白方法證實了Perlecan功能區(qū)V上的HS側鏈帶有負電，通過其吸水性增加組織的容積，可以結合、釋放生長因子，使生長因子暫時失活，并在必要時恢復其活性，具有生長因子儲存庫的作用，并且是細胞粘附分子的重要配體。大量體外研究顯示perlecan作為一種重要的細胞外基質蛋白在機體心血管和軟骨發(fā)育、血管生成與功能調控等多種生命過程中均具有重要作用，提示其在發(fā)育過程中發(fā)揮著廣泛的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Perlecan不僅決定細胞形態(tài)，還控制細胞的生長、分化、調節(jié)細胞受體及基因表達。在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，出生后各時間組中牙胚中perlecan有程度不一的陽性表達，說明Perlecan在牙胚發(fā)育過程中起著非常重要的作用，其對牙胚發(fā)育不僅是起著對牙胚中各種細胞的粘附、擴散及移行的作用，而且，影響著它們的生長與分化。

在牙胚發(fā)育過程中，上皮－間充質起著誘導和調控作用，調控著牙胚的發(fā)育和細胞分化，其作用是通過細胞間產(chǎn)生的信號分子作用來實現(xiàn)的。在牙胚發(fā)育過程中，成釉器和牙乳頭間存在一層基底膜，基底膜可對前成牙本質細胞器誘導作用，而細胞外基質成分作為一種分子信號控制著細胞的分化。本實驗中觀察到自出生0天起，牙囊、成釉細胞一直是強陽性表達，而基底膜一直呈陽性表達。因而推測Perlecan通過控制牙囊、牙本質細胞、成釉細胞的分化，來影響間充質細胞間的相互誘導作用，并通過基底膜成分的介導，從而參與成釉器、牙本質的分化與成熟。

Perlecan在發(fā)育中的必須作用目前尚不知道。但最新發(fā)現(xiàn)Perlecan可以結合成纖維細胞生長因子(fibroblaast geowth factor，F(xiàn)GF)和生長因子結合蛋白。從而提示Perlecan在大鼠牙胚的發(fā)育過程中的作用，還可能與介導FGF等生長因子有關。

Perlecan作為一種重要的細胞外基質蛋白，與機體多種器官的發(fā)育密切相關。本實驗僅提供了Perlecan在牙胚的發(fā)育過程中的時空表達，說明其與牙胚的發(fā)育主要起這調節(jié)和介導作用，而Perlecan在牙胚發(fā)育過程中更詳細的機制還有待于進一步實驗證明。