ＣＯＭＴ基因單核苷酸多態(tài)性與漢族白癜風(fēng)發(fā)病的相關(guān)性

[摘要]目的：探討COMT基因單核苷酸多態(tài)性與漢族尋常型白癜風(fēng)發(fā)病的相關(guān)性。方法：測(cè)定377例漢族尋常型白癜風(fēng)患者及388例正常對(duì)照的兒茶酚鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因第4外顯子158密碼子堿基多態(tài)性?？鼓樘酓NA，用PCR－SSP法和PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法鑒定基因型，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。結(jié)果：COMT基因第4號(hào)外顯子存在一個(gè)G＞A點(diǎn)突變，表現(xiàn)為GG純合、AA純合，GA雜合三種基因型，使其編碼的第158氨基酸由纈氨酸(Val)變成蛋氨酸(Met)。病例組A頻率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：COMT－158位點(diǎn)的多態(tài)性與漢族尋常型白癜風(fēng)具有明確相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]白癜風(fēng)；多態(tài)性；PCR～SSP；COMT基因

[中圖分類號(hào)]R758.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)03－0365－03

白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性疾病，由于各種原因?qū)е潞谒丶?xì)胞數(shù)目減少或功能喪失，表現(xiàn)為皮膚局部白斑，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說，包括自身免疫學(xué)說、細(xì)胞毒學(xué)說、神經(jīng)學(xué)說等，其中由于代謝異常導(dǎo)致局部黑素細(xì)胞毒性損傷的學(xué)說日漸受到重視。兒茶酚鄰位甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)催化兒茶酚胺第3位羥基甲基化，是降解兒茶酚胺的主要代謝酶。文獻(xiàn)表明COMT基因第4號(hào)外顯子存在一個(gè)G＞A點(diǎn)突變使158密碼子從纈氨酸(Val)到蛋氨酸(Met)錯(cuò)義突變，COMT酶活性改變，引起黑素細(xì)胞微環(huán)境毒性兒茶酚胺過量表達(dá)，從而導(dǎo)致黑素細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞。對(duì)中國(guó)漢族人而言，目前尚未見該基因位點(diǎn)多態(tài)性和白癜風(fēng)的相關(guān)報(bào)道。本研究中，我們對(duì)COMT－158 G＞T單核苷酸基因多態(tài)性與白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)系進(jìn)行了深入研究。

1 材料和方法

1．1 一般資料：377例白癜風(fēng)患者均來自西京醫(yī)院皮膚科門診，388名健康成年漢族人來自門診健康查體者。均無遺傳病家族史，無腫瘤、風(fēng)濕病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。治療組平均年齡(24.7±13.6)歲，對(duì)照組平均年齡(26.4±13.3)歲(P＝0.703)。

1．2 DNA提?。夯颊咛顚懼橥鈺殪o脈血10ml，枸櫞酸鈉抗凝，利用血液DNA提取試劑盒提取DNA，采取紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度(mg/m1)和純度(OD260/OD180)。

1．3 COMT基因型的檢測(cè)：引物特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR－SSP)：引物設(shè)計(jì)利用Oligo Primer 5.0PCR引物設(shè)計(jì)軟件，分別針對(duì)COMT－158單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物(表1)。PCR總反應(yīng)體系20μ1：10×緩沖液2.5L，20mmol/L MgCl₂2.5L，25mmol/L dNYP混合物0.2μl，20pmol/L上下游引物各1μl，5 U/μl Taq酶0.3μl，基因組DNA1μl，加高壓滅菌去離子水至20μl。循環(huán)條件為96℃1min，96℃變性20s，75℃退火30s，70℃延伸45s五個(gè)循環(huán)，之后96℃變性25s，65℃退火50s，72℃延伸30s 21個(gè)循環(huán)，之后96℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s五個(gè)循環(huán)，最后20℃ 2min。G等位基因PCR產(chǎn)物455bp，A等位基因PCR產(chǎn)物322bp。通過1.5％瓊酯糖水平凝膠電泳分離鑒定基因型，以DL2000 DNA ladder(Takara)作分子量標(biāo)準(zhǔn)品。

1．4 統(tǒng)計(jì)方法：基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，用Hardy－Weinberg檢測(cè)樣本是否符合孟德爾遺傳規(guī)律；基因型和等位基因頻率差異比較分別采用卡方檢測(cè)，計(jì)算比值比(0R)以及95％可信區(qū)間(CI)來判斷基因COMT－158 G＞A多態(tài)現(xiàn)象與白癜風(fēng)發(fā)病的相關(guān)性，采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件處理(version 8.2；SAS Institute，Inc，Cary，NorthCarolina)。

2 結(jié)果

2．1 等位基因與基因型：圖1所示為2種等位基因和3種基因型電泳圖。GG基因型只可見G組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，從基因型只可見A組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶，GA型可見G組、A組兩組引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物條帶。測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證COMT－158堿基存在二態(tài)性，其堿基可為G或A，在人群中表現(xiàn)為GG純合子，AA純合子和GA雜合子3種基因型，其堿基變化改變了氨基酸編碼，由纈氨酸(Val)變?yōu)榈鞍彼?Met)。

2．2 基因多態(tài)性：3種基因型在所研究漢族正常對(duì)照群體中的分布經(jīng)Hardy－weinberg定律吻合度檢測(cè)，達(dá)到遺傳平衡(P=0.227)，說明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體，證實(shí)抽樣和分型結(jié)果可靠。

2．3 基因型及等位基因分布頻率：如表2所示，GG，GA，從三種基因型頻率在白癜風(fēng)患者中分別占49.6％，42.2％和8.2％；在健康對(duì)照中分別占58.5％，37.4％和4.1％。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三種基因型在尋常型白癜風(fēng)患者和健康對(duì)照人群之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.010)，病例組A等位基因頻率高于正常對(duì)照組(P＝0.049)。

3 討論

COMT有可溶性(S－COMT)和膜結(jié)合性(MB－COMT)兩種分子形式，在人類其編碼基因是同一個(gè)，位于22號(hào)染色體的長(zhǎng)臂11區(qū)帶(22q11)。COMT酶活性個(gè)體間差異很大，在人群中可以分為低活性、中等活性、高活性3種表型，并通過遺傳分析，發(fā)現(xiàn)其表型是由COMTH(高活性)和COMTL(低活性)兩個(gè)等位基因所決定的，以共顯性的方式遺傳。通過對(duì)不同組織和個(gè)體COMT活性的對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)在人類COMT基因第4外顯子存在一個(gè)G＞A點(diǎn)突變，使其編碼的158位氨基酸由纈氨酸(Val)變?yōu)榈鞍彼?Met)，導(dǎo)致COMT酶的活性改變。當(dāng)其108位氨基酸為Met時(shí)，該酶的活性變?yōu)椴荒蜔?，即使在生理?xiàng)l件下，其活性也大大降低。

研究發(fā)現(xiàn)，黑素代謝過程中，代謝產(chǎn)物對(duì)黑素細(xì)胞的自身破壞作用被認(rèn)為與白癜風(fēng)的發(fā)病有關(guān)，而COMT可以阻止在黑素合成中產(chǎn)生的毒性氧化氫醌。這些研究提示我們，低活性COMT酶引起毒性氧化氫醌在黑素細(xì)胞內(nèi)的增加，從而導(dǎo)致黑素細(xì)胞的破壞，可能會(huì)導(dǎo)致白癜風(fēng)的發(fā)生或發(fā)展。Tursen在一項(xiàng)50名白癜風(fēng)患者和66名健康對(duì)照的研究中發(fā)現(xiàn)，在土耳其人群中，COMT－158(G＞A)單核苷酸基因多態(tài)性與面頸型白癜風(fēng)的發(fā)病相關(guān)，而與其他臨床分型無關(guān)。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，COMT－158(G＞A)單核苷酸基因多態(tài)性與尋常型白癜風(fēng)發(fā)病顯著相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Tursen等的結(jié)果差異可能是由于人種的不同所引起，而和他們的研究相比，我們的樣本更大，也更加全面，因此在中國(guó)漢族人群中我們的結(jié)果可靠性更大。大量研究表明，單核苷酸基因多態(tài)性存在著人種的差異。

本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用PCR－SSP方法發(fā)現(xiàn)在中國(guó)漢族人群中基因COMT－158(G＞A)單核苷酸多態(tài)性與尋常型白癜風(fēng)的發(fā)病相關(guān)。但是該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和白癜風(fēng)臨床分型到底有無關(guān)聯(lián)，更大樣本量及重復(fù)研究有重要的意義。而對(duì)功能學(xué)的進(jìn)一步研究來探索COMT基因多態(tài)性與白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)系，則更加能說明白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。