Ｇｌｕｔ－１和ＶＥＧＦ在血管瘤和血管畸形中的表達及意義

[摘要]目的：檢測葡萄糖轉運蛋白－1(Glut－1)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)在血管瘤和血管畸形中的表達，探討他們在血管瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法：采用免疫組化SABC法檢測30例增殖期血管瘤，30例消退期血管瘤，22例血管畸形(10例蔓狀血管瘤和12例海綿狀血管瘤)及5例正常皮膚組織中Glut－1和VEGF的表達。結果：增殖期血管瘤中Glut－1、VEGF的表達均顯著高于消退期血管瘤、血管畸形和正常皮膚(P＜0.01)，消退期血管瘤中Glut－1的表達也明顯高于血管畸形和正常皮膚(P＜0.01)，而消退期血管瘤中VEGF的表達與血管畸形，正常皮膚的差異不具有顯著性(P＞0.05)。結論：Glut－1和VEGF在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到很重要的作用，通過檢測Glut－1在血管瘤和血管畸形中的表達情況能夠比較準確的區(qū)分血管瘤和血管畸形，Glut－1或許可以作為區(qū)分血管瘤和血管畸形的一種較特異的參考指標。

[關鍵詞]血管瘤；血管畸形；Glut－1；VEGF；免疫組織化學

[中圖分類號]R732.2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2006)03－0295－03

皮膚血管瘤是嬰幼兒很常見的一種血管內(nèi)皮細胞良性腫瘤，組織學特征表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞過度增殖。內(nèi)皮細胞增殖失常雖然是血管瘤發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)，但具體的發(fā)病機制尚不清楚。本實驗采用免疫組化SABC法檢測Glut－1和VEGF在不同時期血管瘤和血管畸形及正常皮膚中的表達，從而探討Glut－1和VEGF在血管瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用，旨在初步探討血管瘤發(fā)生發(fā)展的機制。

1 材料和方法

1．1 研究對象：取我院病理科2000年1月至2005年12月經(jīng)病理證實為血管瘤的手術切除標本87例，其中男42例，女45例，年齡1個月～35歲。標本采用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚連續(xù)切片，HE染色后光鏡下按Mulliken標準分類，其中增殖期血管瘤30例，消退期血管瘤30例，血管畸形22例(10例蔓狀血管瘤，12例海綿狀血管瘤)，所有患者術前均未做任何治療，術后經(jīng)病理證實。另取5例含血管的小兒包皮環(huán)切標本做對照。

1．2 檢測方法：①Glut－i、VEGF的檢測：兔抗人Glut－1單克隆抗體(工作濃度1:100，NEO Mark公司)、兔抗人VEGF多克隆抗體(工作濃度1:50，Santa Cruz公司)、即用型SABC試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。采用SABC法檢測兩者在血管內(nèi)皮細胞的表達，詳細步驟按照操作說明書進行。用0.01mol/L的PBS液(pH7.4)代替一抗作陰性對照。鏡下Glut－1以血管內(nèi)皮細胞胞漿和胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性反應，VEGF以血管內(nèi)皮細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為陽性反應。②圖像分析：采用HMIA－2000高清晰度采色醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，每張切片于400倍鏡下，隨機挑取10個視野，每個視野計數(shù)100個血管內(nèi)皮細胞，共1000個細胞中含陽性細胞數(shù)，換算成陽性百分數(shù)，即陽性表達率。

1．3 統(tǒng)計學處理：采用SPSS－13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，各指標以均數(shù)±標準差(x±s)表示，對不同分組間的比較采用方差分析，P＜0.01差異具有顯著性意義。

2 結果

2．1 血管內(nèi)皮細胞中Glut－1，VEGF的表達見表1。

2．2 結果顯示Glut－1在增殖期血管瘤組中的表達率明顯高于消退期血管瘤，血管畸形(蔓狀血管瘤和海綿狀血管瘤)及正常皮膚組，差異有極顯著性(P＜0.01)。在消退期血管瘤組中的表達率也高于血管畸形及正常皮膚組織(P＜0.01)，VEGF在增殖期血管瘤組中的表達率明顯高于消退期血管瘤和血管畸形及正常皮膚組(P＜0.01)，而消退期血管瘤組中的表達與血管瘤形和正常皮膚組的差異無顯著性(P＞0.05)。

3 討論

3．1 先天性血管病變的分類：Mullinken根據(jù)血管內(nèi)皮細胞的增殖狀態(tài)，將先天性血管病變分為血管瘤和血管畸形。二者的臨床表現(xiàn)、組織學特征及血管瘤增殖標志物有著明顯的區(qū)別。血管瘤是由異常增殖的血管內(nèi)皮細胞組成，而血管畸形是血管的異常擴張和溝通，生物學特性與正常血管內(nèi)皮細胞一致，通常在出生時已存在，增長速度和身體的發(fā)育成正比例，不會自行消退。

由于Mullinken分類法是以血管瘤和血管畸形的組織結構、生物學特性以及各種增殖標記物的差異為依據(jù)，從本質(zhì)上揭示了血管瘤和血管畸形的區(qū)別，能夠更好的指導血管病變的診斷、治療及預后，因此已經(jīng)被越來越多的臨床醫(yī)生接受，并應用于臨床實踐中。

3．2 血管瘤和血管畸形中VEGF的表達：已證實VEGF與內(nèi)皮細胞分裂，血管基膜及細胞外基質(zhì)的選擇性降解，內(nèi)皮細胞的遷移等血管形成的重要環(huán)節(jié)有關。具有誘導活體血管形成，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的多種基因表達，可導致內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)暫時性鈣積聚，分裂，遷移等直接作用，還有獨特的促血管通透性的作用，是血管形成和血管滲透性的主要調(diào)節(jié)者。在生理條件下體內(nèi)的大部分細胞VEGF的表達極低。本實驗結果顯示增殖期血管瘤中VEGF的表達明顯高于血管畸形和正常皮膚，且增殖期血管瘤中的表達明顯高于消退期，提示VEGF在血管瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，是判斷血管內(nèi)皮細胞增殖與否的一項具有指導意義的指標。

3．3 血管瘤和血管畸形中Glut－1的表達：Glut是介導細胞攝取葡萄糖的主要載體，到目前為止己經(jīng)有八種葡萄糖轉運蛋白(glucouse transporters)被鑒定(Glutl－5和Glut7－9)，Glut－1是已知的分布最為廣泛的轉運體，然而在正常組織Glut－1的表達主要局限于紅細胞和血－組織屏障的內(nèi)皮，包括腦、眼、神經(jīng)和胎盤，在其他組織細胞中的表達量往往很低。Glut－1表達增高已經(jīng)在卵巢癌、乳腺癌等許多腫瘤中證實，表明Glut－1的過度表達與腫瘤的發(fā)展有著密切地聯(lián)系。

腫瘤細胞生長主要是由葡萄糖代謝來提供能量支持的過程，Glut幾乎出現(xiàn)于所有細胞的細胞膜，并且是葡萄糖進入細胞內(nèi)的主要途徑。Cooper R等人認為腫瘤組織的快速生長導致局部糖原含量減少和細胞缺氧，以致Glut－1蛋白的表達增加，從而增加腫瘤組織對葡萄糖的攝入，為腫瘤組織的快速生長提供能量。血管瘤的一個重要的生物學特征就是血管內(nèi)皮細胞的大量增殖，這樣就和別的腫瘤一樣在局部形成一個缺氧微環(huán)境，糖原含量也急驟減少，HIF－1大量表達，從而促使了HIF下游除Glut－1外CAIX和VEGF等基因的轉錄。Glut－1作為一種缺氧標志物，此時在HIF－1通路和氧化磷酸化雙重調(diào)節(jié)下致使Glut－1基因大量轉錄，Glut－1顯著增多。一些研究表明Glut－1和血清生長因子如EGF、bFGF、PDGF存在正向調(diào)控，但對于癌基因和Glut－1表達的關系仍有爭論，有研究表明存在陽性關聯(lián)，而另外一些研究則提示陰性關聯(lián)。為了更深入一步地理解Glut－1在血管瘤中過度表達的生物學意義，進一步研究Glut－1和一些增殖標志物、癌基因、生長因子之間的聯(lián)系是非常必要的。

本實驗結果顯示Glut－1在血管瘤中均有表達(在增殖期血管瘤中高表達)，而在血管畸形中全部為陰性(與J.Leon－Villapalos等人的實驗結果相似)，這就表明Glut-1對血管瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖起著重要的作用，與血管瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，提示可將其作為鑒別血管瘤和血管畸形的一種參考依據(jù)，特別是對于臨床上診斷有困難的病例。此外針對Glut－1在血管瘤發(fā)生發(fā)展中所起到的重要作用，可以考慮將其作為血管瘤治療的新靶點。己有研究者將Glut－1的反義RNA轉染到腫瘤細胞中抑制Glut－1mRNA的表達使得腫瘤細胞的生長明顯減少。另外還可以將化療藥物與葡萄糖相結合提高血管瘤血管內(nèi)皮細胞中藥物的蓄積，從而加強治療效果。但是Glut－1是通過哪些途徑促進血管內(nèi)皮細胞增殖，它和生長因子之間是如何相互協(xié)調(diào)促進血管瘤的發(fā)生發(fā)展，最后表達水平為何降低，這些問題均有待于進一步深入研究。