納米微囊－ＶＥＧＦ復(fù)合體轉(zhuǎn)染對(duì)慢性創(chuàng)面愈合影響的研究

[摘要]目的：研究納米微囊－VEGF復(fù)合體轉(zhuǎn)染對(duì)慢性創(chuàng)面愈合的影響。方法：以VEGF為目的基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc－h(huán)isA－VEGF165，納米微囊包裹后作用于兔耳慢性創(chuàng)面，于術(shù)后14天通過(guò)創(chuàng)面觀察以及組織學(xué)染色、顯微測(cè)量，觀察其對(duì)創(chuàng)面的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)基因組創(chuàng)面肉芽生長(zhǎng)及上皮爬行速度明顯快于慢性創(chuàng)面組；HE染色轉(zhuǎn)基因組肉芽組織中大量的成纖維細(xì)胞聚集，微血管數(shù)量增多；新生上皮生長(zhǎng)NEG在非缺血?jiǎng)?chuàng)面組最高，慢性創(chuàng)面組最低，其中前者較后者增加249％，而轉(zhuǎn)基因組較慢性創(chuàng)面組增加了165％；肉芽組織厚度PH轉(zhuǎn)基因組較慢性創(chuàng)面組增加了70％，而非缺血?jiǎng)?chuàng)面組較慢性創(chuàng)面組增加了46％；肉芽組織體積NGTV在轉(zhuǎn)基因組及非缺血?jiǎng)?chuàng)面組與慢性創(chuàng)面組比較，分別增加了317％、302％。結(jié)論：非病毒載體納米微囊－VEGF復(fù)合體能明顯促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；慢性創(chuàng)面；愈合；納米微囊；轉(zhuǎn)染

[中圖分類號(hào)]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)03－0291－04

慢性創(chuàng)面的治療一直是臨床工作的難題之一。隨著社會(huì)人口老齡化，臨床病例日漸增多，促使我們不斷探索新的治療途徑。近年來(lái)，外源性生長(zhǎng)因子的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)，并取得一定成績(jī)。而慢性創(chuàng)面愈合的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是新生血管的形成，其中VEGF是已知作用最強(qiáng)的血管生成調(diào)控因素Ⅲ。因此，深入研究VEGF在慢性創(chuàng)面形成中的作用具有深遠(yuǎn)的意義。目前國(guó)外文獻(xiàn)已有外源性重組VEGF在傳統(tǒng)兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面模型的應(yīng)用報(bào)道，但VEGF在創(chuàng)面快速降解的特性也使其給藥途徑具有局限性。

本實(shí)驗(yàn)將納米微囊非病毒截體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)應(yīng)用于兔耳慢性創(chuàng)面研究，這種技術(shù)具有無(wú)免疫原性、較高的轉(zhuǎn)染效率，以及長(zhǎng)時(shí)間緩釋功能等優(yōu)越性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性VEGF基因局部應(yīng)用可以明顯促進(jìn)兔耳慢性創(chuàng)面的愈合，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 納米微囊－VEGF復(fù)合體的制備：參考相關(guān)文獻(xiàn)資料制備帶有VEGF的真核表達(dá)載體(pcDNA3.1/myc－h(huán)isA－VEGF)，取25μl 1.70D上述載體，PBS稀釋至50μl，與10mM納米微囊50μl渦旋振蕩混勻，靜置30min。100μl為每個(gè)創(chuàng)面滴加量。納米微囊－空載質(zhì)粒(不含VEGF基因)作為對(duì)照。

1．2 動(dòng)物模型制作及分組：健康新西蘭白兔8只，48～60月齡，體重3.9～5.0kg(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，利用我們白建的方法構(gòu)建兔耳慢性難愈性創(chuàng)面模型。在耳腹側(cè)制成3個(gè)慢性創(chuàng)面的同時(shí)，另在環(huán)切部位的近端腹側(cè)皮膚制備一個(gè)φ=6mm的圓形創(chuàng)面，作為非缺血對(duì)照。據(jù)此將本實(shí)驗(yàn)共分為三組：轉(zhuǎn)基因組(一側(cè)兔耳慢性創(chuàng)面滴加納米微囊－VEGF復(fù)合體，以CW+VEGF表示)、慢性創(chuàng)面組(另側(cè)兔耳慢性創(chuàng)面滴加空載質(zhì)粒，以CW表示)、非缺血?jiǎng)?chuàng)面組(雙側(cè)兔耳非缺血?jiǎng)?chuàng)面滴加空載質(zhì)粒，以NW表示)。創(chuàng)面包扎、手術(shù)環(huán)節(jié)等步驟均同原文。①CW+VEGF組：明膠海棉薄片蘸取100μl納米微囊－VEGF復(fù)合體覆于每個(gè)創(chuàng)面；②CW組：明膠海棉薄片蘸取100μl空載質(zhì)粒覆于每個(gè)創(chuàng)面；③Nw組：明膠海棉薄片蘸取100μl空載質(zhì)粒覆于每個(gè)創(chuàng)面。

1．3 取材：術(shù)后14天全部動(dòng)物處死，以每一創(chuàng)面為中心，切取1cmx 1cm正方形組織塊(含兔耳全層)，并自創(chuàng)面正中對(duì)稱二等分切開。標(biāo)本迅速固定于中性福爾馬林液，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度5μm)、HE染色。

1．4 創(chuàng)面觀察：觀察各組創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)情況。

1．5 組織學(xué)觀測(cè)：創(chuàng)面橫斷面HE染色，鏡下觀察創(chuàng)緣新生肉芽組織增生情況，并以顯微測(cè)微標(biāo)尺精確測(cè)量上皮間距EG(Epithelial Gap)、肉芽組織間距GTG(Granulation Tissue Gap)及肉芽組織最大厚度PH(Peak Height)，從而得到反映創(chuàng)面愈合的三個(gè)重要指標(biāo)：①新生上皮生長(zhǎng)NEG(New EpithelialGrowth)=6mm－EG；②肉芽組織體積NGTV(NewGranularion Tissue Volume)=肉芽組織面積×PH，其中肉芽組織面積=[(6－GTG)/2]2×π；③肉芽組織最大厚度PH。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所得數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA和post－h(huán)oc檢驗(yàn)，分析組間和兩兩差異，顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)a為0.05。

2 結(jié)果

在術(shù)后3天，CW+VEGF組及NW組已見創(chuàng)緣有很少量肉芽形成及上皮爬行，色澤鮮紅，在7天時(shí)生長(zhǎng)已很明顯。而CW組7天時(shí)尚未見明顯肉芽組織形成。術(shù)后14天，CW組有少量肉芽及上皮化出現(xiàn)，而其它兩組已有多量新生組織，顏色較3天及7天時(shí)稍淡，其中有3例創(chuàng)面完全愈合。

HE染色顯示，14天時(shí)CW組表皮層完整，肉芽組織中大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但成纖維細(xì)胞及新生血管管腔數(shù)量少；而CW+VEGF組新生表皮層較厚，表皮突明顯，肉芽組織中大量的成纖維細(xì)胞聚集，微血管數(shù)量增多，僅散在少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。Nw組與CW+VEGF組差距不明顯。這說(shuō)明在肉芽組織生長(zhǎng)期CW組肉芽增生緩慢，而其他兩組肉芽增生活躍。

在術(shù)后14天，新生上皮生長(zhǎng)NEG在三組之間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。Nw組最高，CW組最低，其中NW組較CW組增加249％，而CW+VEGF組較CW組增加了165％。肉芽組織厚度PH在三組間兩兩比較也有顯著性差異，P＜0.05。CW+VEGF組較CW組增加了70％，而NW組較CW組增加了46％。肉芽組織體積NGTV在CW+VEGF組及NW組無(wú)明顯差異，但與CW組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。它們分別增加了317％、302％。以上結(jié)果表明：與非缺血?jiǎng)?chuàng)面相比，慢性創(chuàng)面的肉芽組織生長(zhǎng)及上皮化速度明顯下降；而轉(zhuǎn)基因組全面提高了慢性創(chuàng)面的愈合指標(biāo)數(shù)據(jù)，尤其對(duì)肉芽組織增生(PH)的促進(jìn)作用較上皮化作用(NEG)更強(qiáng)。

3 討論

近年來(lái)的大量研究表明，生長(zhǎng)因子可以在一定程度上促進(jìn)創(chuàng)面愈合，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)就是其中一類，又稱血管滲透因子(VPF)，它是牛垂體星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)分離出的一種糖蛋白。根據(jù)VEGF mRNA的剪接方式不同，存在5種變異體，分別是：VEGF121、165、189、206、145，其中VEGF165是最多見的蛋白表達(dá)形式。它最主要的功能表現(xiàn)在兩個(gè)方面：①它在體內(nèi)體外都特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)血管生成，是目前最強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原：⑦它還可以增強(qiáng)微血管通透性，導(dǎo)致血漿蛋白廣泛的外漏，其中包括纖維蛋白原、血漿酶原、纖維粘連蛋白等，這些蛋白直接或間接改變了細(xì)胞外基層成份，使其形成暫時(shí)性新基質(zhì)，允許并支持內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的遷移，有利于創(chuàng)傷的修復(fù)。

對(duì)于慢性創(chuàng)面，由于VEGF蛋白及mRNA表達(dá)較正常創(chuàng)面下調(diào)而導(dǎo)致的血管生成下降，這被認(rèn)為是慢性創(chuàng)面不愈合的重要原因之一。由此也為外源性VEGF在慢性創(chuàng)面的應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)。Claudio等通過(guò)兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面模型證實(shí)，外源性重組VEGF可以促進(jìn)缺血?jiǎng)?chuàng)面肉芽組織增生及毛細(xì)血管的生成。當(dāng)劑量為30μg/創(chuàng)面時(shí)，在缺血?jiǎng)?chuàng)面第十日，用藥組肉芽組織面積增加了100％～150％。而在非缺血?jiǎng)?chuàng)面第七日，肉芽組織面積增加了50％～70％。該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了VEGF較bFGF更為有效地促進(jìn)了缺血?jiǎng)?chuàng)面愈合。Zhang等在對(duì)鼠缺血皮瓣模型及缺血傷口模型的研究中發(fā)現(xiàn)，外源性VEGF能夠明顯促進(jìn)皮瓣的血管形成及傷口的抗張力強(qiáng)度，提高皮瓣的成活率及加速傷口愈合。另有研究者將VEGF121 cDNA組裝成PCS－121，用脂質(zhì)體包裹用于腹壁上動(dòng)脈皮瓣早期斷蒂的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PCS－121組皮瓣成活面積93.9％，明顯高于對(duì)照組的28.1％、31.9％。

目前，在創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域內(nèi)VEGF的給藥方式主要有蛋白注入和基因轉(zhuǎn)染兩種。蛋白注入方式因技術(shù)簡(jiǎn)便，作用直接、見效較快，故采用較多。其方法有：皮內(nèi)、皮下、筋膜下、肌肉內(nèi)、動(dòng)靜脈內(nèi)注射、靜脈滴注等。Padubridri等將5μg重組VEGF注入10cm×10cm軸型皮瓣血管蒂，提高了皮瓣成活面積。Kryget等報(bào)道多次高濃度靜脈給藥效果最佳。但是，VEGF蛋白不穩(wěn)定，易水解成為沒(méi)有活性的單體，其半衰期僅為6min，而且VEGF蛋白價(jià)格昂貴，單次較大劑量應(yīng)用時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂，故蛋白注入給藥方式具有很大局限性。近年來(lái)隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的飛速發(fā)展，VEGF轉(zhuǎn)基因治療成為一種使其在局部持續(xù)發(fā)揮作用的有效方法。由于VEGF為分泌性蛋白，有信號(hào)肽序列，即使基因轉(zhuǎn)染的效率較低也可能發(fā)揮明顯的生物學(xué)效應(yīng)，其一次給藥就可獲得短期內(nèi)持續(xù)表達(dá)，且需要的質(zhì)粒DNA量較少。Baumgartner報(bào)道在10外病變部位分別接受總量4000μg質(zhì)粒的治療，結(jié)果7例血管造影證實(shí)有新生側(cè)枝血管，8處肢體遠(yuǎn)端血流改善，其效果等同于或優(yōu)于外科手術(shù)及介入治療。所以在本實(shí)驗(yàn)中采用新型材料納米微囊為載體包裹VEGF質(zhì)粒，通過(guò)局部給藥促進(jìn)了兔耳慢性創(chuàng)面的愈合，而國(guó)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，納米微囊載體在動(dòng)物體內(nèi)依然有較高的轉(zhuǎn)染效率。

在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，慢性創(chuàng)面組肉芽組織生長(zhǎng)及上皮爬行緩慢，在7天時(shí)尚未見明顯肉芽形成，14天時(shí)也僅有少量肉芽及上皮化出現(xiàn)，較其它兩組差別較大，這印證了該動(dòng)物模型的可靠性。HE染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述觀察。在14天時(shí)慢性創(chuàng)面成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞增生不活躍，新生毛細(xì)血管管腔數(shù)量少，而其它兩組細(xì)胞增生相對(duì)活躍。這導(dǎo)致了慢性創(chuàng)面與非缺血?jiǎng)?chuàng)面在愈合速度上的差距，同時(shí)也說(shuō)明外源性VEGF基因?qū)肽苡行岣呗詣?chuàng)面愈合速度。正常創(chuàng)面的愈合修復(fù)過(guò)程大致分三個(gè)階段：①炎性滲出期：傷后48h內(nèi)以炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)為主；②肉芽組織形成期：48h以后，血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞活躍增生，在損傷后5天，肉芽組織增生進(jìn)入一個(gè)高峰期，7～14天后肉芽組織形成逐漸減少；③組織重塑期，3～4周后肉芽組織逐漸瘢痕化。對(duì)本實(shí)驗(yàn)慢性創(chuàng)面的觀察顯示，其愈合過(guò)程中細(xì)胞及肉芽組織增生能力下降，愈合過(guò)程延遲。通過(guò)顯微測(cè)微標(biāo)尺對(duì)組織切片的精確測(cè)量更準(zhǔn)確地反映了三組創(chuàng)面愈合上的差距：新生上皮的生長(zhǎng)NEG值，非缺血?jiǎng)?chuàng)面較慢性創(chuàng)面增加了249％，而轉(zhuǎn)基因創(chuàng)面增加了165％；肉芽組織厚度PH值，非缺血?jiǎng)?chuàng)面增加了46％，轉(zhuǎn)基因創(chuàng)面增加了70％；肉芽組織體積NGTV值，雖然非缺血?jiǎng)?chuàng)面與轉(zhuǎn)基因創(chuàng)面比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較慢性創(chuàng)面分別增加了302％、317％。值得注意的是，轉(zhuǎn)基因治療后，PH值增加明顯，顯著大于非缺血?jiǎng)?chuàng)面，說(shuō)明VEGF對(duì)肉芽組織增生的誘導(dǎo)作用較強(qiáng)；而NEG值小于非缺血?jiǎng)?chuàng)面，表明轉(zhuǎn)基因雖然也促進(jìn)了慢性創(chuàng)面的新生上皮化，但上皮遷移速度尚不及非缺血組，這也決定了其最終愈合時(shí)間要落后于非缺血?jiǎng)?chuàng)面。

關(guān)于轉(zhuǎn)基因治療尚有許多問(wèn)題值得探討，如外源基因是整合入基因組還是瞬時(shí)表達(dá)、在靶器官的表達(dá)持續(xù)時(shí)間、在基因停止表達(dá)后新生血管是否能持久存在、表達(dá)后蛋白效應(yīng)與內(nèi)源性VEGF蛋白效應(yīng)是否有區(qū)別以及局部應(yīng)用是否會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官病理性血管增生，以及其具體的作用機(jī)理我們將進(jìn)一步深入研究。