血管緊張素Ⅱ?qū)υ錾择：鄢衫w維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響

目的：探討血管緊張素Ⅱ及其Ⅰ型受體(AT₁)拮抗劑洛沙坦(losartan)對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。方法：體外分離培養(yǎng)增生性瘢痕戍纖維細(xì)胞，在不同濃度的血管緊張素Ⅱ、losartan、PD123319作用下，觀察成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并繪制生長(zhǎng)曲線，采用MTT法和3H－TDR摻入釋放法分別檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖和DNA含量的情況。結(jié)果：血管緊張素Ⅱ在濃度為10^-8Smol/L～10^-5mol/L時(shí)，成纖維細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，DNA含量增加(P＜0.05)；losartan能幾乎完全抑制AngⅡ的這種作用，PD123319對(duì)此作用幾乎沒(méi)有影響。結(jié)論：AngⅡ可促增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，該作用主要通過(guò)AngⅡ的Ⅰ型受體介導(dǎo)完成，AT₁的拮抗劑有望在增生性瘢痕防治中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]血管緊張素Ⅱ；洛沙坦；細(xì)胞增殖；增生性瘢痕；成纖維細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q343.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)03－0298－04

增生性瘢痕是以成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和膠原蛋白無(wú)序沉積為主要特征的結(jié)締組織疾病。其發(fā)病機(jī)制至今尚未徹底闡明。血管緊張素Ⅱ(an－giotensin Ⅱ，AngⅡ)作為腎素一血管緊張素系統(tǒng)中重要的因子，通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌等方式發(fā)揮其多種生物功能。其經(jīng)典作用是引起血管收縮和調(diào)節(jié)水鹽平衡。目前越來(lái)越多的研究結(jié)果認(rèn)為Ang Ⅱ作為一種生長(zhǎng)因子，是一種強(qiáng)烈的有絲分裂原，在促進(jìn)心肌間質(zhì)、腎臟間質(zhì)、肺間質(zhì)以及血管壁纖維化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究的目的在于觀察Ang Ⅱ及其Ⅰ型受體拮抗劑洛沙坦(losartan)對(duì)來(lái)源于人類增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的影響，為探索增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制及防治方法提供資料。

1 材料和方法

1．1 主要試劑：Ang Ⅱ、Losartan、PD123319(美國(guó)Sigma)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone)；3H－TDR(北京原子能研究所)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Serva分裝)；醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司YJ－875型)；CO²培養(yǎng)箱(美國(guó)SHEL－LAB1815TC型)。

1．2 取材標(biāo)準(zhǔn)：①增生性瘢痕，瘢痕色澤紅，質(zhì)硬，高出皮膚表面，均為燒傷創(chuàng)面愈合已超過(guò)3個(gè)月，但瘢痕仍持續(xù)增生，瘢痕局部無(wú)感染和潰瘍，均未曾使用抗瘢痕藥物、彈力加壓、放療等方法治療；②病人無(wú)高血壓、肝硬化、肺纖維化、慢性腎炎、心肌梗塞等疾?。虎鄄∪藷o(wú)全身感染、腫瘤；④無(wú)結(jié)締組織疾病或可能影響結(jié)締組織代謝的疾病，未全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇等藥物治療；⑤瘢痕局部癥狀典型。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為四組：①對(duì)照組：20％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液：②Ang Ⅱ組：培養(yǎng)液中加入Ang Ⅱ，濃度范圍10％^-9mol/L～10^-5mol/L；③Ang Ⅱ+losartan組：培養(yǎng)液中先加入lO^-9mol/L～10^-5mol/L的losartan預(yù)處理30min，再加入同濃度AngⅡ；④AngⅡ+PD123319組：培養(yǎng)液中先加入10^-9mol/L～10^-5mol/L的PD123319預(yù)處理30min，再加入同濃度AngⅡ。

1．4 成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)：采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，將手術(shù)中切下的符合條件的增生性瘢痕在無(wú)菌條件下切除其表皮，在少量胎牛血清中將標(biāo)本切成1mm³左右的組織塊置于培養(yǎng)瓶中，在95％空氣、5％CO₂、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)6～8h，使組織塊牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基適量，繼續(xù)培養(yǎng)，3～4天換液1次，2～3周后，原代細(xì)胞生長(zhǎng)成單層，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例傳代培養(yǎng)，此后每2～3天換液1次，每4～5天分種傳代1次，實(shí)驗(yàn)用第3～5代細(xì)胞。

1．5 繪制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線：取成纖維細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/ml的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔含有0.5ml的培養(yǎng)液，待其鋪滿培養(yǎng)板80％時(shí)，換成含0.5％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，再分別加入不同濃度的Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan，Ang Ⅱ+PD123319，每一濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立只加入培養(yǎng)基的對(duì)照組。培養(yǎng)24h后用0.25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別收集各孔細(xì)胞，用PBS洗滌后計(jì)數(shù)。

1．6 Ang Ⅱ和losartan對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響：用MTT法測(cè)定成纖維細(xì)胞的增殖情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔含150μl的培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后，換成含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，再分別加入不同濃度Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan、Ang Ⅱ+PD123319，每一濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立只加入DMEM培養(yǎng)基的對(duì)照組。細(xì)胞繼續(xù)孵育24h后，在已培養(yǎng)細(xì)胞的96孔板每孔中加入0.5％MTT 10μl，置于37℃4h后，棄上清，加入100tμl DMSO(二甲基亞砜)震蕩15min后，使形成的甲月贊(formazan)充分溶解。然后在酶標(biāo)儀上測(cè)測(cè)定波長(zhǎng)570nm處的吸光值。

1．7 3H～TDR摻入釋放法檢測(cè)成纖維細(xì)胞中DNA的含量：將細(xì)胞以5×10⁴個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔含150μl的培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后，換成含無(wú)血清的培養(yǎng)液，再分別加入不同濃度Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan、Ang Ⅱ+PD123319，每一濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立只加入DMEM培養(yǎng)基的對(duì)照組。細(xì)胞繼續(xù)孵育24h后，培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化約2mim棄胰蛋白酶加入D—Hank’s液洗滌細(xì)胞數(shù)次后，收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上；再經(jīng)10％三氯醋酸和無(wú)水乙醇沉淀、固定后，置于70℃烘箱內(nèi)烘干；將濾膜放入有閃爍液的液閃杯中測(cè)量樣本的放射脈沖數(shù)(以dpm值表示)。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，以SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)、相關(guān)分析及多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與同一對(duì)照組的比較的方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況：當(dāng)Ang Ⅱ的濃度為10^-8～10^-5mol/L時(shí)，成纖維細(xì)胞增殖明顯，且與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。而AngⅡ+losar－tan組中，成纖維細(xì)胞的增殖不受Ang Ⅱ的影響，與對(duì)照組相比也無(wú)顯著差異。而Ang Ⅱ+PD123319組與AngⅡ組結(jié)果相似，無(wú)顯著差異。

2．2 MTT法測(cè)成纖維細(xì)胞的增殖：MTT比色法A570nm吸光度值顯示：當(dāng)Ang Ⅱ的濃度為10^-8～10^-5mol/L時(shí)，成纖維細(xì)胞增殖明顯，且與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。而Ang Ⅱ+losartan組中，成纖維細(xì)胞的增殖不受Ang Ⅱ的影響，與對(duì)照組相比也無(wú)顯著差異。Ang Ⅱ+PD123319組與Ang Ⅱ組結(jié)果相似，無(wú)顯著差異。見(jiàn)表1。

H3－TDR摻入釋放法檢測(cè)成纖維細(xì)胞中DNA的含量變化：以H3－TDR摻入dpm值代表細(xì)胞內(nèi)DNA含量。結(jié)果表明，AngⅡ在10^-8～10^-5mol/L濃度范圍內(nèi)，成纖維細(xì)胞的DNA含量明顯增多，與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)；而Ang Ⅱ+losartan組中，成纖維細(xì)胞的增殖不受Ang Ⅱ的影響，與對(duì)照組相比也無(wú)顯著差異。Ang Ⅱ+PD123319組與Ang Ⅱ組結(jié)果相似，與AngⅡ組無(wú)顯著差異。見(jiàn)表2。

3 討論

腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是機(jī)體調(diào)節(jié)血管張力和水鈉代謝的內(nèi)分泌系統(tǒng)的組成部分，隨血液循環(huán)發(fā)揮作用。血管緊張素Ⅱ是RAS系統(tǒng)的主要活性成分。目前，以AngⅡ?yàn)橹饕蜃拥腞AS在一些組織器官的纖維化過(guò)程中的重要作用正逐漸引起越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。在纖維化過(guò)程中，局部組織的RAS激活，包括AngⅡ在內(nèi)的一些因子表達(dá)水平升高，提示局部RAS可能參與了組織器官纖維化和/或結(jié)構(gòu)重構(gòu)過(guò)程。這樣的器官包括肝臟、腎臟、心臟、肺和皮膚。ACE抑制劑、Ang Ⅱ受體拮抗劑和阻斷劑等可通過(guò)不同方式延緩和/或抑制器官纖維化的發(fā)生，進(jìn)一步說(shuō)明Ang Ⅱ有促器官纖維化的作用。Ang Ⅱ受體主要分為AT₁、AT₂兩種亞型，AT₁受體是一種膜受體，它具有激素受體的所有特征。它介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ受體的大部分生理功能。Sun等檢測(cè)到AT₁在心肌纖維母細(xì)胞上的表達(dá)，Bril－la等通過(guò)3H－TDR摻入釋放法和膠原酶活性分析法發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ在10^-7mol/L時(shí)心肌纖維母細(xì)胞大量增殖，膠原合成增加。有學(xué)者在腎臟間質(zhì)、肺組織、肝組織中也檢測(cè)到了AT₁受體，研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ能促進(jìn)這些器官組織的纖維化。

增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)面愈合后瘢痕持續(xù)增生的一種病理表現(xiàn)，其機(jī)制目前還不清楚。近年來(lái)的研究表明，AngⅡ能促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，提示AngⅡ在人類瘢痕形成可能具有獨(dú)特的作用。劉宏偉等研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕形成過(guò)程中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶和血管緊張素Ⅱ表達(dá)增加，提示在瘢痕形成過(guò)程中皮膚局部RAS系統(tǒng)的激活，在瘢痕的形成和調(diào)控中發(fā)揮作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，來(lái)源于人增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞受到濃度高于10^-8mol/L的Ang Ⅱ刺激時(shí)增殖明顯，且與AngⅡ的濃度呈正相關(guān)關(guān)系，濃度越高增殖越明顯。AngⅡ的Ⅰ型受體AT₁的拮抗劑losartan能夠完全抑制該作用，而Ang Ⅱ的Ⅱ型受體拮抗劑PD123319對(duì)此作用沒(méi)有影響。

通過(guò)以上結(jié)果推測(cè)，在增生性瘢痕發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用的成纖維細(xì)胞，在AngⅡ的作用下，通過(guò)結(jié)合該細(xì)胞上的受體AT₁，大量激活并增殖，而AT₁的拮抗劑losartan通過(guò)阻斷AT₁，減少成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。腎素一血管緊張素系統(tǒng)可能參與了瘢痕的形成，對(duì)皮膚局部的RAS系統(tǒng)的研究可能在探索瘢痕增生的機(jī)制和皮膚創(chuàng)面及瘢痕治療方面開辟一個(gè)新的途徑。