超薄表皮片移植細(xì)胞異位的初步研究

[摘要]目的：了解超薄表皮片移植中干細(xì)胞的分化和分布的狀況，初步探討創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞異位現(xiàn)象的存在。方法：超薄表皮片用中性蛋白酶分離自人環(huán)切術(shù)的包皮，反復(fù)沖洗使表皮干細(xì)胞脫落。分別用HE染色、免疫組化和DAPI標(biāo)記后移植于8只裸鼠。第4天和第7天活殺取材，常規(guī)HE和石蠟與冰凍切片染色。用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡觀察皮片的形態(tài)學(xué)改變，用免疫組化的方法評(píng)估表達(dá)角蛋白19和14細(xì)胞的分化和分布。結(jié)果：染色顯示未移植皮片有正常的層次結(jié)構(gòu)，但移植的皮片細(xì)胞層次有松弛紊亂的跡象，免疫組化顯示CK14和CK19陽(yáng)性細(xì)胞有異位現(xiàn)象；冰凍切片熒光顯微鏡下在基底層之外亦見有孤立成團(tuán)同時(shí)雙染的CK19陽(yáng)性細(xì)胞。這些現(xiàn)象在移植后的第4天最為顯著。結(jié)論：表皮細(xì)胞在超薄表皮片移植中顯示出CK14和CK19陽(yáng)性細(xì)胞有異位現(xiàn)象，這種特異性細(xì)胞的異位可能參與了創(chuàng)面修復(fù)以及之后表皮重塑。

[關(guān)鍵詞]表皮片；干細(xì)胞；移植；裸鼠；創(chuàng)面修復(fù)

[中圖分類號(hào)]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008－6455(2007)03－0313－04

皮片移植是燒傷治療中最常用的手術(shù)方式，由于刃厚皮片較薄，生長(zhǎng)所需條件低，在感染創(chuàng)面上生長(zhǎng)容易及供皮區(qū)不受限等特點(diǎn)，因此在治療大面積燒傷及其他皮膚疾病起著舉足輕重的作用。刃厚皮片移植到有血運(yùn)的創(chuàng)面后，早期靠創(chuàng)面滲出的血清維持營(yíng)養(yǎng)，5～24h后，皮片與受區(qū)創(chuàng)面間有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)受區(qū)創(chuàng)面向皮片生長(zhǎng)血管芽，48h到達(dá)真皮與表皮的結(jié)合處，初步形成新生的毛細(xì)血管，因此皮片易于在創(chuàng)面成活，7天左右可建立良好的血運(yùn)。值得注意的是，長(zhǎng)期以來(lái)人們關(guān)注創(chuàng)基條件對(duì)皮片成活的影響，輕視了皮片本身細(xì)胞的增殖分化能力對(duì)創(chuàng)面愈合的作用。刃厚皮片移植后細(xì)胞的增殖分化是如何進(jìn)行的?鮮見有文獻(xiàn)報(bào)道。故筆者以分離的超薄的表皮片為研究對(duì)象，建立了表皮片移植后的細(xì)胞示蹤模型，觀察在基底層細(xì)胞相對(duì)不足的情況下表皮細(xì)胞增殖分布特點(diǎn)，為以后進(jìn)一步研究表皮細(xì)胞的增殖分化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 包皮來(lái)自無(wú)泌尿系感染等疾病7～25歲行包皮環(huán)切術(shù)的患者。經(jīng)知情同意由解放軍空軍總醫(yī)院泌尿外科提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為裸鼠，體重20g左右，許可證號(hào)：SCXK京2004－0001，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院宣武動(dòng)物所；麻醉劑速眠新Ⅱ(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獸醫(yī)研究所)。

1．1．2 消化液：中性蛋白酶(dispose)，以D～hanks分別配制2mg/ml中性蛋白酶溶液，過(guò)濾滅菌后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．1．3 DAPI(Sigma)染液：稱取1mg DAPI，用DMEM/F－12(GiBCO)培養(yǎng)液溶解定容至20ml，0.22μm微孔慮膜過(guò)濾除菌，4℃下避光保存。工作濃度為50μg/ml。

1．1．4 抗體：鼠抗人角蛋白10、14和19IgG單抗(福州邁新)，山羊抗鼠IgG2(北京中山)，以熒光素羅丹明標(biāo)記的山羊抗鼠IgG2(北京中山)，兩步法細(xì)胞免疫化學(xué)。

1．2 方法

1．2．1 表皮片的處理：將包皮剪切成約2.0cm×2.0cm左右的皮片，中性蛋白酶消化4℃過(guò)夜；吸棄dispase，D－Hanks液清洗后，仔細(xì)分離表皮層，設(shè)立未處理組，其余真皮面向上，用D－Hanks反復(fù)吹打漂洗進(jìn)行預(yù)處理。

1．2．2 皮片移植和取材：將處理的表皮片移植前3h，加入DAPI染液，避光孵育3h，用Hank’s液沖洗7次以上去除未結(jié)合DAPI。根據(jù)無(wú)菌操作，裸鼠麻醉后，每只裸鼠背部人為設(shè)計(jì)0.5cm²大小的1～4個(gè)創(chuàng)面，創(chuàng)基噴rhEGF和bFGF，將處理過(guò)的超薄表皮片移植于8只裸鼠背部，纖維蛋白膠封閉創(chuàng)面，內(nèi)襯少許紗布，創(chuàng)可貼包扎。

1．2．3 取材及標(biāo)本制作：?jiǎn)位\密閉包喂養(yǎng)4～8天，隨機(jī)于第四天和第七天引頸活殺取材，分別制作石蠟(厚度3～5μm)和冰凍切片(厚度4～7μm)。常規(guī)滴加一抗及熒光標(biāo)記的第二抗體，甘油封片。光鏡及熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2．1 皮片的染色結(jié)果：分離的表皮片在HE染色及免疫組織化學(xué)染色下，表皮片細(xì)胞排列規(guī)律整齊，細(xì)胞層次較為明顯。CK10用陽(yáng)性細(xì)胞多分布于表皮淺層，CK14分布在基底層及棘細(xì)胞層甚至顆粒層。未行預(yù)處理的表皮片CK19染色可見陽(yáng)性細(xì)胞單層排列于基底層，呈波浪狀。而經(jīng)預(yù)處理的表皮片僅見少量CK19陽(yáng)性細(xì)胞排列于基底層，基底層細(xì)胞排列不連續(xù)。

2．2 裸鼠及移植皮片的成活情況：裸鼠共8只，其中有3只試驗(yàn)結(jié)束前死亡，其原因可能是麻醉及包扎過(guò)重所致。皮片移植后，分別于第四天和第七天取材。打開包扎裸鼠創(chuàng)面較移植前縮小，至第七天縮小更明顯。排除脫落，共13個(gè)創(chuàng)面，兩個(gè)創(chuàng)面皮片未成活，系包扎不確切所致，11個(gè)創(chuàng)面皮片成活良好，顏色尚可。HE染色顯示表皮細(xì)胞極性分布存在，皮片松弛，大體細(xì)胞層次增多，皮片變厚，創(chuàng)基有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2．3 石蠟切片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：鏡下CK14陽(yáng)性細(xì)胞較未移植前增多，排列紊亂，在皮片內(nèi)分散分布，個(gè)別部位可見分布擁擠現(xiàn)象。CK19陽(yáng)性細(xì)胞脫離基底層，可見分散孤立的分布于皮片內(nèi)。移植的皮片細(xì)胞層次有松弛紊亂的跡象。上述現(xiàn)象在移植后的第四天最為顯著。但系列切片未觀察到“干細(xì)胞島”現(xiàn)象。

2．4 冰凍切片：DAPI熒光及免疫組化染色結(jié)果：熒光顯微鏡下，在藍(lán)色波長(zhǎng)下觀察到移植表皮片區(qū)域有藍(lán)色密集顆粒，系DAPI標(biāo)記細(xì)胞的表皮細(xì)胞核，其與鼠源性組織的自發(fā)熒光區(qū)分度較為明顯。紅光激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，在560nm波長(zhǎng)觀察可見皮片內(nèi)有少量的羅丹明標(biāo)記山羊抗鼠IgG的明顯著色，排列不規(guī)律。鼠源性組織有著色區(qū)，可能是冰凍切片較厚而造成的假陽(yáng)性。

3 討論

表皮分為五層，從里向外依次是：基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層、透明層及角質(zhì)層。具有增殖能力的細(xì)胞包括表皮干細(xì)胞和短暫擴(kuò)充細(xì)胞，它們主要定位于表皮基底層和棘細(xì)胞層，通常認(rèn)為CK19和CK14分別是他們分化的階段性標(biāo)記物。中性蛋白酶能溫和地分離去除真皮層，獲得的超薄表皮片內(nèi)含有基底層細(xì)胞在內(nèi)的各層表皮細(xì)胞。理論上講，位于基底層的表皮干細(xì)胞由于失去的基底膜的貼附，在機(jī)械沖擊下更容易分離下來(lái)。結(jié)果表明在機(jī)械沖擊下基底層細(xì)胞CK19陽(yáng)性細(xì)胞的連續(xù)性斷裂，說(shuō)明表皮干細(xì)胞減少。表皮于細(xì)胞是皮膚發(fā)生、修復(fù)、重塑的關(guān)鍵性源泉。對(duì)于修復(fù)皮膚缺損的皮膚移植物，表皮的永久再生需要有干細(xì)胞移植其中。那么將這些表皮干細(xì)胞相對(duì)不足的表皮片移植至創(chuàng)面上又會(huì)怎樣呢?HE染色觀察到皮片移植后，皮片松弛變厚，表皮細(xì)胞極性分布存在，總體細(xì)胞層次增多，創(chuàng)基有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在創(chuàng)面愈合過(guò)程中，該皮片一方面通過(guò)自身的細(xì)胞增殖參與創(chuàng)面愈合，另一方面在創(chuàng)口逐漸收縮的過(guò)程中，皮片變厚，從而在質(zhì)和量上加固創(chuàng)面。免疫組織化學(xué)顯示，較移植前，CK14陽(yáng)性細(xì)胞增多，皮片內(nèi)分散存在，個(gè)別部位可見排列擁擠。而CK19陽(yáng)性細(xì)胞脫離基底層，可見分散孤立的分布于皮片內(nèi)。在熒光顯微鏡下可見到少量DAPI和CK19同時(shí)著色的陽(yáng)性細(xì)胞，分布不規(guī)律。這種特異性的角質(zhì)形成細(xì)胞的極性分布紊亂現(xiàn)象在移植后的第四天最為顯著。那么如何解釋在表皮片中出現(xiàn)的CK14及CK19陽(yáng)性細(xì)胞的異位分布現(xiàn)象?由于在皮片移植之前對(duì)表皮片進(jìn)行示蹤，熒光顯微鏡下在皮片內(nèi)未見到DAPI陰性而角蛋白陽(yáng)性著色的細(xì)胞，基本上排除了異源性細(xì)胞浸入皮片內(nèi)的可能。我們推斷，在上皮－間質(zhì)界面形成由復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)組成的“微環(huán)境”的作用下，可能有以下原因：一是ESC和TAC產(chǎn)生了“跳躍”，即伴隨著機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)信號(hào)的啟動(dòng)，ESC和TAC快速地向表皮上層遷移，能動(dòng)的參與創(chuàng)面的修復(fù)；二是由于機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)的緊迫性，雖然ESC和脫離表皮基底層進(jìn)入了分化狀態(tài)而形成了短暫TAC，TAC進(jìn)而分化為PMD細(xì)胞，但這些TAC和PMD細(xì)胞的狀態(tài)尚屬幼年期，仍表達(dá)更為原始細(xì)胞的某些特征；三是是否存在由成熟的表皮細(xì)胞逆分化為ESC樣細(xì)胞或TAC樣細(xì)胞。成熟細(xì)胞可通過(guò)去分化、轉(zhuǎn)分化和逆分化方式向腫瘤細(xì)胞、其他(胚層的)成熟細(xì)胞和干細(xì)胞轉(zhuǎn)變。這些細(xì)胞可能在喪失表達(dá)原細(xì)胞蛋白分子或結(jié)構(gòu)特征的同時(shí)，合成和裝配了新生細(xì)胞的蛋白，從而完成成體細(xì)胞的異常分化(逆分化和/或轉(zhuǎn)分化)過(guò)程。但其中具體的分子生物學(xué)機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。如何解釋特異性的角質(zhì)形成細(xì)胞的異位現(xiàn)象在移植后的第四天最為顯著的現(xiàn)象?皮片移植第四天是血運(yùn)正在建立但仍未穩(wěn)定時(shí)期，血液循環(huán)呈擺動(dòng)或呆滯的緩慢移動(dòng)。此時(shí)的皮片逐漸適應(yīng)新的環(huán)境，表皮細(xì)胞處于缺血及缺氧狀態(tài)，加上人為添加的rhEGF及bFGF在局部產(chǎn)生的作用，由此復(fù)雜的共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所產(chǎn)生了一系列的分子生物學(xué)效應(yīng)，可能導(dǎo)致了上述三種可能機(jī)制的發(fā)生。事實(shí)上，體外的實(shí)驗(yàn)研究中第四天也是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。McGann cJ等利用早期蠑螈的肢體再生提取物來(lái)誘導(dǎo)C2C12小鼠的肌管，觀察到最大量的肌管進(jìn)入細(xì)胞周期并形成增殖性的單個(gè)核細(xì)胞發(fā)生于第三天，第四天呈持續(xù)狀態(tài)。Shuibing Chen等用一種名為“逆轉(zhuǎn)素”的小分子物質(zhì)誘導(dǎo)C2C12肌管。加入該物質(zhì)后4天后，肌管形成完全被抑制，細(xì)胞不斷地形成單核細(xì)胞群，肌漿蛋白特異標(biāo)志如MyoD和myosin培養(yǎng)開始消失，此后細(xì)胞在成骨或脂肪誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)為相應(yīng)再分化細(xì)胞特異性標(biāo)記物。這種體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)在時(shí)間上的巧合，是否提示四天之中細(xì)胞獲得了可塑性，在發(fā)育上發(fā)生了根本性的逆轉(zhuǎn)；這種細(xì)胞異常分化的節(jié)點(diǎn)是一種必然還是偶然值得探討。本實(shí)驗(yàn)觀察到特異性的角質(zhì)形成細(xì)胞的異位分布及皮片增厚的現(xiàn)象，我們考慮不能排除表皮細(xì)胞在超薄表皮片移植中顯示出逆分化和再分化。這種特異性細(xì)胞的異位可能參與了創(chuàng)面修復(fù)以及之后表皮重塑。