角質(zhì)形成細(xì)胞源ＩＬ－１α對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及膠原分泌的影響

[摘要]目的：研究角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-1α對(duì)成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法：組織塊法培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，消化法培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞，采用免疫組化方法檢測(cè)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-1α；成纖維細(xì)胞中加入含不同濃度IL-1α抗體(0．04μg／ml，0．2μg／ml，1μg／ml)的角質(zhì)形成細(xì)胞條件培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)組，含DMEM的條件培養(yǎng)液為對(duì)照組，采用Cell counting kit-8、放免法測(cè)定成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成。結(jié)果：細(xì)胞爬片可見大量染色陽性角質(zhì)形成細(xì)胞，細(xì)胞增殖測(cè)定，各實(shí)驗(yàn)組吸光度(A)值與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ＜0．01)；隨抗體濃度增高，A值減小，0．2μg／ml及1μg／ml濃度組與0．04μg／ml濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ＜0．01)；膠原分泌濃度測(cè)定，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ＜0．01)；隨抗體濃度及膠原濃度增高，0．2μg／ml及1μg／ml濃度組與0．04μg／ml濃度組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ＜0．01)。結(jié)論：正常角質(zhì)形成細(xì)胞分泌大量IL-1α，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，抑制膠原分泌。

[關(guān)鍵詞]角質(zhì)形成細(xì)胞；IL-1α；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；膠原分泌

[中圖分類號(hào)]R329．2⁺8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008—6455(2006)12-1337-02

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：30371469)

通訊作者：郭樹忠，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，科主任；

E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn

角質(zhì)形成細(xì)胞能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并抑制其膠原合成，這種作用是由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的各種活性因子來實(shí)現(xiàn)的。但角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的每一種因子對(duì)成纖維細(xì)胞到底有什么具體作用，現(xiàn)在研究的還不是很清楚。IL-1α是角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的重要因子，可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞大量基因的表達(dá)，影響多種生物活性因子合成與分泌，也是角質(zhì)形成細(xì)胞-成纖維細(xì)胞相互作用環(huán)路中的一個(gè)主要因子。但其對(duì)成纖維細(xì)胞的具體作用仍不明確，故我們對(duì)其進(jìn)行了研究。

1 資料和方法

1．1材料：無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(Keratinocyte-SFM，KSFM，Gibco公司，美國)，DispaseⅡ酶(Gibco公司，美國)，DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，Gibco公司，美國)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，人Ⅲ型前膠原(PCⅢ)放免試劑盒(海研所)，Cell countingkit-8(CCK-8，Dojindo，日本)，IL-1α抗體(RD公司，美國)，生物素化兔抗山羊IgG和ABC復(fù)合物(Vector公司，美國)。

1．2細(xì)胞培養(yǎng)

1．2．1角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)：選用正常小兒包皮組織(來自包皮環(huán)切術(shù))，按常規(guī)角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)正常的角質(zhì)形成細(xì)胞。細(xì)胞融合達(dá)80％～90％時(shí)換為無生長(zhǎng)因子的角質(zhì)形成細(xì)胞專用培養(yǎng)基，48h后收集上清，-70℃保存?zhèn)溆?。用前以DMEM稀釋配制成50％的濃度。

1．2．2皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，常規(guī)消化、傳代，實(shí)驗(yàn)選用第2～10代細(xì)胞。新生牛血清濃度為10％。

1．3方法

1．3．1角質(zhì)形成細(xì)胞源IL-1α測(cè)定：采用免疫組化方法。將蓋玻片置于6孔板中，加入角質(zhì)形成細(xì)胞(二代)。當(dāng)細(xì)胞爬片融合近80％時(shí)取出，0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(Phosphate-buffed saline，PBS)浸洗5min×3次，4％多聚甲醛固定15min；再次PBS浸洗5rain×3次，山羊抗IL-1抗體(1u／ml)孵育切片，室溫下24h，后用PBS再浸洗5min×3次；生物素化的兔抗山羊IgG(1：400)孵育切片，室溫下4h，PBS浸洗5min×3次；生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(ABC復(fù)合物，1：500)孵育切片，室溫2h。蘇木精染液行細(xì)胞核襯染，中性樹膠封片，光鏡下觀察。陰性對(duì)照：一抗用牛血清白蛋白稀釋液替代。

1．3．2 IL-1α對(duì)成纖維細(xì)胞增殖作用測(cè)定：采用CCK-8試劑盒。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞。胰酶消化，含10％小牛血清的DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴／ml，每孔200μl接種于96孔中，過夜后棄去上清，每孔加入DMEM培養(yǎng)24h，細(xì)胞處于70％～80％融合狀態(tài)，棄上清，再加入不同濃度條件培養(yǎng)液(conditioned media，CM)180μl(90μl50％濃度上清液+90μl含不同濃度抗體PBS)，共5組，每組重復(fù)6孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入CCK-8 10μl，2～3h后在450nm處測(cè)吸光度A值。

1．3．3細(xì)胞上清液中PCⅢ含量的測(cè)定：采用放免試劑盒，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×10⁵／ml，接種于48孔板中，每孔200μl，過夜后棄去上清換為不同濃度的條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1天，取上清液100μl，用放免法測(cè)定上清液中PCⅢ的含量。

1．3．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以互x±s表示。細(xì)胞增殖及膠原分泌數(shù)據(jù)采用兩兩比較Snq-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1在免疫組化片中，陽性組可見大量胞漿被染成棕黃色的角質(zhì)形成細(xì)胞，以牛血清白蛋白稀釋液作為對(duì)照的未見明顯胞漿陽性細(xì)胞(圖1、2，見中插2)。

2．2角質(zhì)形成細(xì)胞源IL-1α對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響：IL-1α對(duì)成纖維細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用，以IL-1α抗體阻斷后，CM促增殖作用減弱；隨IL-1α抗體濃度增高，CM促增殖作用漸減弱，在0．2μg／ml時(shí)達(dá)高峰¹ρ＜0．01，²ρ＜0．01)，表1。

2．3角質(zhì)形成細(xì)胞源IL-1α對(duì)成纖維細(xì)胞分泌Ⅲ前膠原的影響

IL-1α抑制成纖維細(xì)胞膠原分泌，以IL-1α抗體阻斷后，CM促膠原分泌增強(qiáng)；隨IL-1α抗體濃度增高，分泌膠原濃度增高，在0．2μg／ml時(shí)達(dá)高峰(³ρ＜0．01，⁴ρ＜0．01)，表1。

3 討論

在炎癥期，IL-1α主要是由巨噬細(xì)胞分泌，而在傷口愈合后期，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分泌，在我們的免疫組化片中，可見到大量染色陽性的細(xì)胞，可見在增殖狀態(tài)的角質(zhì)形成細(xì)胞中，確實(shí)合成并分泌大量的IL-1α。

IL-1α是角質(zhì)形成細(xì)胞一成纖維細(xì)胞相互作用環(huán)路中的重要中介物質(zhì)，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-1α，引起成纖維細(xì)胞分泌大量的KGF、IL-6，再反作用于角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)其增殖。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)IL-1α對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用，在以中和抗體阻斷其作用后，成纖維細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，而這種作用在0．20μg／ml濃度時(shí)達(dá)到最強(qiáng)，這與我們以前實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。這可能是由于：①IL-1α作為一個(gè)炎性因子，確實(shí)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖；②IL-1α引起其他生長(zhǎng)因子的釋放，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。角質(zhì)形成細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，可引起成纖維細(xì)胞343條基因發(fā)生變化，其中，69條基因編碼一系列生長(zhǎng)因子、化學(xué)因子、細(xì)胞因子及他們的受體?；虮磉_(dá)調(diào)高的主要因子有EGF、FGF、VEGF、IL-8、PAL-1、IGFBP-3、PGE等，而大部分因子的變化全部由角質(zhì)形成細(xì)胞源IL-1α介導(dǎo)，其余的由IL-1α部分介導(dǎo)。故IL-1α可通過使這些因子的高表達(dá)促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

在膠原合成與分泌方面，IL-1α一直被認(rèn)為是一個(gè)促進(jìn)膠原降解的因子。以IL-1α抗體阻斷其作用后，發(fā)現(xiàn)雖然總的成纖維細(xì)胞數(shù)量減少了，但在上清液中測(cè)到的三型前膠原量卻增加了。目前，學(xué)者認(rèn)為這主要是由于IL-1α可引起成纖維細(xì)胞分泌大量的MMP-1、MMP-3，促進(jìn)了膠原的降解；同時(shí)IL-1α抑制成纖維細(xì)胞分泌CTGF，而CTGF是一強(qiáng)有力的促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞合成膠原的因子。IL-1α的合成減少，正是增生性瘢痕的形成原因之一。Niessen FB測(cè)定12個(gè)月后仍然呈增生狀態(tài)的瘢痕發(fā)現(xiàn)其表皮層中所含的IL-1α量明顯低于正常瘢痕及已漸萎縮的增生性瘢痕，而在3個(gè)月時(shí)，在基底層及血管周圍IL-1α高表達(dá)的增生性瘢痕在12個(gè)月后趨于正常的可能性明顯增高。

由此，我們?cè)O(shè)想在對(duì)一些難愈創(chuàng)面或者愈合后瘢痕增生發(fā)生幾率極高的創(chuàng)面進(jìn)行治療時(shí)，在早期即投入大量外源性IL—1α，彌補(bǔ)角質(zhì)形成細(xì)胞的分泌不足，或者對(duì)這些分泌不足的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，使其能大量分泌IL-1α，應(yīng)該能達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，減少瘢痕的作用。

雖然角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的IL-1α介導(dǎo)成纖維細(xì)胞一角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用，其分泌的多少對(duì)創(chuàng)面愈合及增生性瘢痕的產(chǎn)生有密切關(guān)系，但創(chuàng)面愈合、瘢痕增生是大量因子的綜合作用結(jié)果，故我們需要繼續(xù)對(duì)IL-1α及其他重要因子間的協(xié)同作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。

[收稿日期]2006-09-14 [修回日期]2006-12-15

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。