ＩＧＦ－１Ｒ抗體對(duì)兔耳瘢痕組織的影響

作者：陶蕓，趙亞南，王繼華，張景波，肖鴻，劉紅莉

[摘要]目的：觀察胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-1R)抗體對(duì)兔耳增生性瘢痕組織的影響。 方法：建立兔耳增生性瘢痕動(dòng)物模型，21天后瘢痕局部注射不同濃度的IGF-1R抗體或生理鹽水，連續(xù)7天，觀察1個(gè)月。分別對(duì)瘢痕增生指數(shù)(hypertrophicindex，HI)、成纖維細(xì)胞數(shù)和膠原含量的變化進(jìn)行比較。結(jié)果：一定劑量IGF-1R抗體組HI值、成纖維細(xì)胞數(shù)量以及膠原含量比對(duì)照組減少(ρ＜0．01或0．05)。 結(jié)論：IGF-1R抗體能抑制兔耳瘢痕組織增生。

[關(guān)鍵詞]胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體；增生性瘢痕；動(dòng)物模型

[中圖分類(lèi)號(hào)]R619+．6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2006)12—1334—03

[基金項(xiàng)目]云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(04J876C)

通訊作者：趙亞南，男，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

E-mail：yzha04@hotmail．com

傷口愈合后期成纖維細(xì)胞增殖及合成、分泌旺盛，引起細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積導(dǎo)致增生性瘢痕的形成。生長(zhǎng)因子持續(xù)刺激是創(chuàng)傷愈合后瘢痕增生的原因之一，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)能促進(jìn)細(xì)胞分化，又與成纖維細(xì)胞增殖、活躍程度密切相關(guān)，是影響創(chuàng)面愈合的重要因子之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕中大量表達(dá)IGF-1及其受體，并認(rèn)為可能與瘢痕的形成密切相關(guān)。本研究即利用外傷性兔耳早期瘢痕增生模型，觀察并研究IGF-1R抗體對(duì)增生性瘢痕組織的影響，初步探討IGF-1及其受體與瘢痕增生的關(guān)系。

1 材料和方法

1．1試劑及儀器：IGF-IR抗體購(gòu)自深圳晶美生物制品有限公司。XSB211型OLYMPUS光學(xué)顯微鏡、TD-2000真彩色病理顯微圖像分析系統(tǒng)和LEICA RM2145超薄切片機(jī)由昆明醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；LEICA DM 6000B病理圖像分析儀由云南藥物研究所提供。

1．2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康日本大耳白兔20只，雌雄各半，體重

2．2～2．6kg，購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1．3實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1動(dòng)物模型的建立：兔適應(yīng)性喂養(yǎng)72h，用3％戊巴比妥鈉(1ml／kg)耳緣靜脈注射麻醉。在兔雙耳腹側(cè)部分沿長(zhǎng)軸避開(kāi)可見(jiàn)血管，分別做6個(gè)直徑1．0cm的圓形切口，切口間隔1．0cm，完整切除全層皮膚，去除軟骨膜，用熱金屬絲點(diǎn)灼創(chuàng)緣皮膚，至輕微結(jié)痂，達(dá)到充分止血，術(shù)畢創(chuàng)面用無(wú)菌紗布包扎固定。每只兔12個(gè)創(chuàng)面，共240個(gè)創(chuàng)面。術(shù)后一周去痂，自然愈合。術(shù)后21天左右，約有90％的創(chuàng)面形成外觀凸起的瘢痕組織，隨機(jī)取樣，病理證實(shí)為外傷性早期兔耳瘢痕增生。

1．3．2動(dòng)物組別和處理：兔耳瘢痕模型制作成功后，隨機(jī)將每只兔耳的8個(gè)瘢痕塊分為4組：生理鹽水溶劑對(duì)照組(A組)、IGF-1R Ab 1．5μg／ml劑量組(B組)、3．0μg／ml劑量組(C組)和6．0μg／ml劑量組(D組)，共20只兔，故A～D組各有瘢痕塊40個(gè)。術(shù)后第21天，分別對(duì)各組瘢痕基底部及瘢痕灶內(nèi)注射不同濃度的IGF-1R抗體或生理鹽水，每日注射1次，持續(xù)7天，每次注射用量為20μl。

1．3．3標(biāo)本取材及處理：用藥后第3、7、11、20、30天，在同樣的麻醉?xiàng)l件下切取瘢痕組織及周?chē)＝M織標(biāo)本于10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，行蘇木素一伊紅染色(HE)和膠原染色(VG)。光鏡下觀察HE染色切片，用測(cè)微尺測(cè)出瘢痕最高點(diǎn)至耳軟骨表面的垂直厚度(a)、瘢痕周邊正常皮膚至耳軟骨表面的垂直厚度(b)，測(cè)算出瘢痕增生指數(shù)(hypertrophic index，HI=a／b)。每張組織切片分別隨機(jī)選5個(gè)不重疊視野(×200)，HE染色切片鏡下目測(cè)計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞數(shù)、VG染色切片定量檢測(cè)膠原面密度的變化。

1．3．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，采用SPSS11．5軟件包做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2．1形態(tài)學(xué)觀察：兔耳腹側(cè)形成創(chuàng)面后，傷口約13～16天愈合，上皮化時(shí)即能觸到硬塊，此硬塊不斷高于皮膚，21～23天時(shí)增生達(dá)到高峰，厚度約為兔耳腹面正常皮膚厚度的2-3倍，質(zhì)硬，色紅。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谏睇}水對(duì)照組瘢痕仍維持較明顯的增生狀態(tài)，充血明顯呈紫紅色，質(zhì)硬；B～D組瘢痕均出現(xiàn)萎縮，表現(xiàn)為瘢痕體積減小，充血減輕，變平變軟、色澤變淺，其中C、D組最為明顯。

2．2組織學(xué)觀察

2．2．1 HE染色切片：與正常的兔耳全層結(jié)構(gòu)相比，生理鹽水對(duì)照組和B-D組瘢痕組織均厚于正常組織，尤其生理鹽水對(duì)照組，可厚達(dá)正常組織的3倍，表皮呈波浪狀明顯增厚。實(shí)驗(yàn)組軟骨有明顯的增生，炎性細(xì)胞較多，成纖維細(xì)胞核大、增生旺盛，毛細(xì)血管增生明顯，膠原纖維粗大，排列紊亂。瘢痕淺部可見(jiàn)環(huán)形或漩渦狀分布，深部則平行排列于軟骨，軟骨增生明顯。B～D組瘢塊內(nèi)成纖維細(xì)胞減少、核變細(xì)小，胞質(zhì)減少，瘢痕厚度較薄，可見(jiàn)少量毛細(xì)血管；以C、D組明顯(圖1、2，見(jiàn)中插1)。

2．2．2 VG染色切片：對(duì)照組膠原纖維呈紅色，細(xì)胞顏色淺灰，散在分布于膠原纖維問(wèn)。與對(duì)照組比較，C、D組的膠原纖維染色較淡，較為疏松，纖維排列較為規(guī)整(圖3，見(jiàn)中插1)。

2．3瘢痕增生指數(shù)：各組在不同時(shí)相點(diǎn)的HI值結(jié)果見(jiàn)表1，B～D組HI值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低而A組則逐漸升高，C、D兩組各時(shí)間點(diǎn)均比生理鹽水對(duì)照組降低(ρ＜0．01或0．05)。

2．4成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)和膠原面密度測(cè)量值：見(jiàn)表2、3。結(jié)果顯示：與A組比較，C、D組成纖維細(xì)胞和膠原面密度減少非常明顯(ρ＜0．01)，B組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

增生性瘢痕是整形外科基礎(chǔ)研究的重要課題之一，研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子在瘢痕形成中起作用，其中IGF-1及其IGF-1R介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)瘢痕形成可能起著十分重要的作用，能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原等胞外基質(zhì)，影響創(chuàng)面愈合后組織的改建。體外實(shí)驗(yàn)表明，生理濃度的IGF-1即可有效抑制成纖維細(xì)胞的凋亡，維持細(xì)胞的生存；IGF-1R激活后還可上調(diào)許多細(xì)胞因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和創(chuàng)面愈合后瘢痕的形成。Ghahary等研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1能降低燒傷后增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞合成膠原酶mRNA的水平和膠原酶的活性。Ishihara檢測(cè)到增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纖維細(xì)胞大量表達(dá)IGF-1受體，并且認(rèn)為由此抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生或打破了細(xì)胞增殖和凋亡的平衡，進(jìn)而使得細(xì)胞外基質(zhì)大量表達(dá)和沉積。

嚴(yán)重炎癥或傷口愈合延遲等原因?qū)?huì)導(dǎo)致增生性瘢痕的形成，增生性瘢痕以排列不規(guī)整、漩渦狀或團(tuán)塊狀的膠原大量沉積和旺盛增生的成纖維細(xì)胞為特征。雖然對(duì)這種改變的生物機(jī)制尚不清楚，但已發(fā)現(xiàn)病變部位膠原合成明顯高于正常皮膚，而成纖維細(xì)胞則是膠原生成的主要來(lái)源。因此，能調(diào)控成纖維細(xì)胞的增生或增殖，將會(huì)明顯減輕瘢痕的增生，改善創(chuàng)面的修復(fù)。近年來(lái)有關(guān)IGF-1及IGF-1R的研究認(rèn)為，IGF-1具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌、產(chǎn)生纖維性蛋白的作用，并能促進(jìn)皮膚的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生纖維粘連蛋白、1型前膠原的前a1(Ⅰ)鏈和Ⅲ型前膠原的前al(Ⅲ)鏈的mRNA表達(dá)增加。IGF-1的功能主要靠與IGF-1受體結(jié)合來(lái)介導(dǎo)完成，別的生長(zhǎng)因子如血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及其受體可誘導(dǎo)產(chǎn)生IGF-1又能增加IGF-1連接位點(diǎn)的數(shù)量，還采用IGF-1自泌途徑來(lái)刺激細(xì)胞增殖，甚至PDGF、EGF受體的促分裂作用和轉(zhuǎn)化潛能也可能與IGF-1R有關(guān)。靶向破壞EGF受體或PDGF受體時(shí)，可使細(xì)胞在一定程度上得到抑制，但有些細(xì)胞通過(guò)表達(dá)IGF-1R，這種抑制作用可得到阻止，生長(zhǎng)作用得以恢復(fù)。阻斷IGF-1R，便能下調(diào)其他生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，因此，通過(guò)靶向破壞IGF-1受體或受體基因比破壞其它生長(zhǎng)因子或受體基因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用更徹底。

從對(duì)兔耳增生性瘢痕的研究看，局部注射一定濃度外源性的IGF-1R的抗體能有效減輕瘢痕增生的程度，使其變軟變平，顏色變淺，瘢痕增生指數(shù)也明顯降低。另外，通過(guò)HE和VG染色觀察到，與對(duì)照組A組比較，注射后第三天B、C和D組的成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)和膠原纖維面密度開(kāi)始降低，并且持續(xù)到第30天，但只有C和D組的降低與對(duì)照組比較有顯著性差異。說(shuō)明兔耳瘢痕生長(zhǎng)過(guò)程中，IGF-1R抗體可能阻斷了IGF-1與IGF-1R的結(jié)合，直接抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，從而減少膠原的合成、分泌；另外，可能通過(guò)膠原酶的增加、膠原酶活性的增強(qiáng)，促使已形成的膠原纖維降解、重吸收，減輕瘢痕組織的增生。

本實(shí)驗(yàn)中能較長(zhǎng)時(shí)間抑制瘢痕的增生，除了IGF-1及其受體的作用受影響外，還可能阻止了別的生長(zhǎng)因子如EGF、FGF及其受體與IGF-1R的協(xié)同作用的發(fā)揮，進(jìn)一步抑制了IGF-1的促成纖維細(xì)胞增殖和促瘢痕增生的作用，改變了增生性瘢痕持續(xù)增生的狀態(tài)。

應(yīng)用兔耳增生性瘢痕模型，觀察阻斷IGF-1與其受體的結(jié)合對(duì)增生性瘢痕的抑制作用，較體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)真實(shí)可靠，為人類(lèi)增生性瘢痕機(jī)制的研究提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但I(xiàn)GF-1及IGF-1R或與其他生長(zhǎng)因子及受體對(duì)瘢痕增生影響的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

[收稿日期]2006-09-11 [修回日期]2006-12-08

編輯／張惠娟

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。