雞傳染性支氣管炎病毒血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，阮 震，張 穎，梅建國，苗立中

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.濱州市濱城區(qū)里則街道辦事處畜牧獸醫(yī)工作站，山東濱州 256656）

雞傳染性支氣管炎（Avian infectious bronchitis，IB）是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性、呼吸道傳染病。IB呈世界性流行，是危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重大傳染病之一，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，已發(fā)現(xiàn)IBV有30多種血清型，且常與其他病原發(fā)生混合或繼發(fā)感染，從而給IBV檢測(cè)增加了難度。為快速準(zhǔn)確檢測(cè)IBV，從血清學(xué)和分子生物學(xué)方面開發(fā)檢測(cè)技術(shù)，是目前IB防控研究的重要內(nèi)容。

1 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1.1 血凝和血凝抑制試驗(yàn)（HA&HI）

HA&HI主要用于IBV抗原及抗體的檢測(cè)。陸蘋等[1]用1%胰蛋白酶處理后的尿囊液，來制備抗原，從而提高了檢測(cè)的靈敏性和特異性。由于HI抗原制作過程繁瑣，抗原效價(jià)不穩(wěn)定，病毒濃度與HA滴度無線性關(guān)系，HI滴度與保護(hù)力在免疫期內(nèi)無相關(guān)性，故該方法還無法應(yīng)用于IBV的免疫監(jiān)測(cè)。

1.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

AGP操作簡便、快速、特異性強(qiáng)、要求條件低、費(fèi)用小，已被廣泛應(yīng)用于IBV抗體檢測(cè)。杜恩歧等[2]用IBV LX4毒株N基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體，純化蛋白后免疫所得多抗與不同型毒株進(jìn)行AGP，發(fā)現(xiàn)該抗體可與不同毒株發(fā)生反應(yīng)，說明重組蛋白可作為群特異性診斷抗原用于IBV診斷。但由于AGP敏感性差，以及不能區(qū)分疫苗株和感染毒株，因而實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。

1.3 病毒中和試驗(yàn)（VN）

VN是鑒定IBV的經(jīng)典方法，可在雞胚、雞胚腎細(xì)胞或氣管環(huán)培養(yǎng)物上進(jìn)行，多用于IBV野毒株的分離、鑒定和分型。秦卓明等[3]用氣管環(huán)交叉VN試驗(yàn)，對(duì)IBV山東分離株的血清型進(jìn)行了鑒定并獲得成功。雖然該方法的靈敏性和特異性均較好，但操作復(fù)雜，耗時(shí)長，且必須在較高要求的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。

1.4 熒光抗體技術(shù)（FA）

FA主要用于IBV抗原、抗體檢測(cè)及抗原組織定位。20世紀(jì)90年代已有多人對(duì)該方法進(jìn)行了研究，并獲得了滿意結(jié)果。IBV感染SPF雞7 d后，應(yīng)用IFA對(duì)其不同臟器進(jìn)行跟蹤檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在氣管、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等組織細(xì)胞中均不同程度地出現(xiàn)特異性熒光。FA方法雖然直觀、特異，抗原定位獨(dú)特，但需熒光顯微鏡及較嚴(yán)格的時(shí)間限制。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

1.5.1 間接ELISA 間接ELISA主要用于IgM和IgG抗體檢測(cè)。付潤饒[4]、鄭衛(wèi)峰等[5]先后建立了IBV全病毒抗原間接ELISA方法，用于疫苗免疫后雞血清中特異性抗體檢測(cè)。李廣興等[6]以IBV重組表達(dá)的N蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)IBV抗體的間接ELISA方法，為IBV快速診斷和流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。孫羅美等[7]、苗立中等[8]先后以IBV重組表達(dá)的S1蛋白為包被抗原，建立了檢測(cè)IBV抗體的間接ELISA方法。Ding等[9]人工合成了選自IBV的S、M和N蛋白多片段抗原作為包被抗原，建立了檢測(cè)IBV抗體的間接ELISA。間接ELISA為IBV的免疫抗體監(jiān)測(cè)、臨床野毒感染快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種敏感、特異、高通量的檢測(cè)技術(shù)。

1.5.2 斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA） 該方法以硝酸纖維素膜等固相化基質(zhì)膜為載體，用于抗原、抗體檢測(cè)，早在20世紀(jì)90年代末就已建立。閻芳等[10]將Dot-ELISA與生物素、親和素系統(tǒng)相結(jié)合，建立了IBV ABC-Dot-ELISA方法，對(duì)自然感染和人工感染的病料的檢出效果較好，檢出率分別達(dá)到70%和85%左右，顯著高于AGP。

1.5.3 夾心及雙抗夾心ELISA 該方法分別利用多克隆抗體、單克隆抗體（MAb）作為一抗、二抗，并采用標(biāo)記抗鼠IgG為指示系統(tǒng)，用于IBV早期感染的抗原檢測(cè)，并且可以區(qū)分病毒株或血清型，適合于病料和感染雞胚尿囊液的IBV檢測(cè)。王林川等[11]認(rèn)為單抗包被反應(yīng)板要優(yōu)于多抗、病毒包被反應(yīng)板。季文彬[12]建立的雙抗體夾心ELISA特異性好，可重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果可靠，為IB防控提供了良好的診斷方法。

1.5.4 捕獲ELISA 白妍[13]利用制備的IBV B11株單抗，成功建立和優(yōu)化了抗原捕獲ELISA方法。該方法具有很好的敏感性和特異性，適合大規(guī)模樣本的快速檢測(cè)。

1.6 膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）

王澤霖等[14]建立的對(duì)IBV銀加強(qiáng)金標(biāo)免疫檢測(cè)技術(shù)（SECGA）不需特殊設(shè)備，檢測(cè)快速、簡便，是較有前途的新檢測(cè)技術(shù)，但對(duì)金標(biāo)二抗的濃度和活性要求很高。蘇磊等[15]建立的IBV免疫膠體金診斷試紙條技術(shù)的特異性、靈敏性、穩(wěn)定性均比IBV雙抗夾心ELISA要高，且所需時(shí)間短，15 min后即可判定結(jié)果。鄭衛(wèi)峰[16]成功制備了IBV免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，為IB的早期診斷和防治，以及與其它禽類呼吸道感染的快速鑒別提供了有力的技術(shù)手段。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.1 RT-PCR

RT-PCR方法具有敏感、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，既可利用通用引物檢測(cè)不同來源、不同血清型的IBV，對(duì)于某些差異較大的毒株，也可通過設(shè)計(jì)型特異性引物來區(qū)分不同的IBV毒株。針對(duì)變異率較高的S1蛋白等設(shè)計(jì)引物，可以實(shí)現(xiàn)血清型或基因型的特異性擴(kuò)增；而針對(duì)N、M等保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，則可以實(shí)現(xiàn)群特異性擴(kuò)增。劉金朋等[17]根據(jù)IBV N基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了RT-PCR方法。于申業(yè)等[18]根據(jù)IBV 793/B株S1基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)IBV 793/B的RT-PCR方法。程曉霞等[19]根據(jù)IBV M基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)IBV的RT-PCR方法。姚四新等[20]根據(jù)IBV ZZ2004 3a、3b及E基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)IBV ZZ2004變異株的RT-PCR方法。高文倩等[21]根據(jù)IBV強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株序列差異設(shè)計(jì)引物，建立了一種基于免疫磁珠富集IBV后，檢測(cè)S1基因多變區(qū)的多重RT-PCR方法，可以快速鑒別IBV強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株，為IBV檢測(cè)提供了新的技術(shù)支持。

2.2 熒光定量RT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與普通RT-PCR相比，特異性和靈敏度都更高，是一種IBV快速檢測(cè)的新方法。王鵬等[22]、于新友等[23]、苗立中等[24]分別根據(jù)IBV N、M、E基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)IBV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法。梁耀峰等[25]根據(jù)IBV N基因序列設(shè)計(jì)特異的H52株熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和Taq Man-MGB探針，建立了快速檢測(cè)IBV H52株檢測(cè)方法。屈素潔等[26]在國內(nèi)首次針對(duì)IBV N基因和NDV NP基因，設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了同時(shí)檢測(cè)IBV和NDV的雙重?zé)晒舛縍T-PCR，實(shí)現(xiàn)了多種病原的同時(shí)檢測(cè)。

2.3 環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）

RT-LAMP技術(shù)是在RT-PCR基礎(chǔ)上建立的一種新型核酸檢測(cè)方法，具有簡便、快速高效、敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合基層業(yè)務(wù)部門及養(yǎng)殖場(chǎng)的檢測(cè)。劉宇卓等[27]根據(jù)IBV M基因設(shè)計(jì)引物建立了RTLAMP方法，其檢測(cè)極限比RT-PCR更高，具有良好的特異性和敏感性。馬利[28]根據(jù)5a+5b基因序列設(shè)計(jì)引物，范瑾[29]根據(jù)M基因設(shè)計(jì)引物，鮮思美等[30]根據(jù)N基因設(shè)計(jì)引物，分別建立了檢測(cè)IBV RT-LAMP方法。

2.4 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)具有高度特異、敏感、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。孟凡磊等[31]根據(jù)IBV N基因序列設(shè)計(jì)引物，成功制備出地高辛標(biāo)記的IBV核酸探針，對(duì)IBV的最低檢出量為10 pg。莫?jiǎng)偬m等[32]用地高辛標(biāo)記IBV pol基因保守片段制作探針，克服了RT-PCR非特異性反應(yīng)和探針Northern雜交的不穩(wěn)定性。

2.5 基因芯片技術(shù)

該技術(shù)是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)，具有高通量，并行性和結(jié)果判讀客觀、準(zhǔn)確及信息化等特點(diǎn)。曹三杰等[33]首次成功制備了NDV-IBV-AIV-IBDV基因芯片。趙玉佳等[34]構(gòu)建了聯(lián)合檢測(cè)NDV、IBV、ILTV的基因芯片。楊國淋等[35]則在此基礎(chǔ)上，將不對(duì)稱PCR和基因芯片結(jié)合，同時(shí)增加cy3標(biāo)記引物濃度，從而提高了芯片探針與靶基因的雜交效率和靈敏度?；蛐酒夹g(shù)克服了常規(guī)生物學(xué)方法僅能對(duì)少數(shù)靶標(biāo)基因檢測(cè)的缺點(diǎn)，減少了結(jié)果判斷的主觀因素，能夠同時(shí)對(duì)多種混合感染疾病進(jìn)行診斷。

3 小結(jié)

由于IBV基因組核酸在復(fù)制過程中易發(fā)生突變和高頻重組，因而該病毒血清型多，變異株不斷出現(xiàn)，且不同血清型之間交叉保護(hù)力弱，常導(dǎo)致免疫失敗，使得IB難以有效控制。臨床上IB與新城疫、禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻氣管炎等的癥狀類似，必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行確診。雖然IBV血清學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)方法的研究有了較大進(jìn)展，但每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)際檢測(cè)中，可以根據(jù)檢測(cè)目的不同，結(jié)合實(shí)際條件，選擇適宜的檢測(cè)方法或?qū)追N方法結(jié)合起來使用。相信隨著實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的不斷研究與應(yīng)用，尤其是分子生物學(xué)研究的更加深入，IBV檢測(cè)技術(shù)將會(huì)得到不斷發(fā)展和完善。參考文獻(xiàn)：

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當(dāng) C1＞2Fr1＋E0＋m 時(shí)， 是r0的增函數(shù)，當(dāng)高昂的科技研發(fā)費(fèi)用成為企業(yè)開展綠色化生產(chǎn)模式的最大負(fù)擔(dān)時(shí)，金融機(jī)構(gòu)的優(yōu)惠利率能夠吸引企業(yè)通過技術(shù)創(chuàng)新開展綠色化生產(chǎn)模式。當(dāng)C1＜2Fr1＋E0＋m時(shí)，P?1是r0的減函數(shù)，此時(shí)企業(yè)的科技研發(fā)投入與主營業(yè)務(wù)收入及政府補(bǔ)貼相比差距較大，金融機(jī)構(gòu)優(yōu)惠的貸款利率不是企業(yè)選擇走綠色化生產(chǎn)模式的決定因素。

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