室內(nèi)灰塵中五溴聯(lián)苯醚(BDE-99)干擾Dio3影響斑馬魚(yú)甲狀腺功能調(diào)節(jié)

尹曉宇，董文靜，李嘉偉，齊澈力木格，于永利，楊景峰，董武

內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)毒物監(jiān)控及毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，通遼 028000

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是溴化阻燃劑(BRF)類的化學(xué)物質(zhì)，由于其高性能、低成本和獨(dú)特的理化性質(zhì)，已成為世界上使用最廣泛的阻燃劑之一。它是一類含溴原子的芳香族化合物，根據(jù)溴原子在苯環(huán)上的取代位置和個(gè)數(shù)的不同，PBDEs可分為209種同分異構(gòu)體[1]。雖然，PBDEs作為阻燃劑使用成本低廉，但由于它們?cè)诃h(huán)境中不易降解，且具有較高的生物累積潛力以及潛在毒性，導(dǎo)致它們被歸類為新型持久性環(huán)境有機(jī)污染物[2]。研究者發(fā)現(xiàn)，PBDEs在家庭灰塵中、魚(yú)體內(nèi)和淤泥中大量蓄積，且PBDEs在人體內(nèi)蓄積，可能會(huì)導(dǎo)致胎兒畸形和甲狀腺功能失調(diào)。Johnson-Restrepo和Kannan[3]比較了室內(nèi)灰塵和攝入食物中的PBDEs濃度，認(rèn)為室內(nèi)灰塵是PBDEs暴露的主要途徑。Smielowska和Zabiegala[4]發(fā)現(xiàn)，PBDEs沉積在由于重力下落而產(chǎn)生的粉塵(即懸浮顆粒物)上，因此，粉塵是PBDEs的重要儲(chǔ)藏環(huán)境和來(lái)源。Bu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209、BDE-47和BDE-99是室內(nèi)沉降塵埃中最主要的化合物。Zhu等[6]也發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)灰塵被PBDEs污染，并且中國(guó)東部地區(qū)的PBDEs濃度高于西部地區(qū)，城市地區(qū)的PBDEs濃度高于農(nóng)村地區(qū)，這表明，社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展對(duì)PBDEs污染水平具有重大影響。塵土中的PBDEs很難降解，因此，被聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)和聯(lián)合國(guó)工業(yè)開(kāi)發(fā)組織(UNIDO)列為持久性有機(jī)污染物(POPs)，被叫做POP-PBDEs[7]，且塵土中的PBDEs易被生物利用并具有生物活性。塵土中的PBDEs可通過(guò)呼吸進(jìn)入肺部，從而進(jìn)入血液循環(huán)，對(duì)健康造成一定的威脅。尤其辦公室環(huán)境中PBDEs的暴露，可能導(dǎo)致上班人群受PBDEs的嚴(yán)重危害[8-9]。

有關(guān)多溴聯(lián)苯醚的毒性機(jī)理，可能與改變血液中的甲狀腺激素水平及其受體有關(guān)，PBDEs對(duì)甲狀腺功能的影響，主要表現(xiàn)在影響甲狀腺素在血清中的水平[10]或甲狀腺素調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)。Arkoosh等[11]發(fā)現(xiàn)，鮭魚(yú)中BDE-99的攝入會(huì)降低血液循環(huán)中四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)的濃度。Qian等[12]發(fā)現(xiàn)，小鼠在妊娠和哺乳期暴露于BDE-209，其甲狀腺素脫碘酶的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)受到影響，后代血清中的甲狀腺激素(THs)水平進(jìn)而受到破壞，從而可能導(dǎo)致后代小鼠的神經(jīng)功能受損。Han等[13]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)親本暴露于BDE-209，會(huì)對(duì)F1代產(chǎn)生發(fā)育毒性，并破壞后代的甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)。

斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，因其具有胚胎透明、發(fā)育迅速、便于觀察和操作、對(duì)藥物極其敏感及可利用資源極其豐富等諸多優(yōu)勢(shì)，而被廣泛應(yīng)用。使用斑馬魚(yú)胚胎評(píng)價(jià)PBDEs的毒性及其作用機(jī)制，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。在本研究中，針對(duì)家庭及辦公室灰塵中的PBDEs含量進(jìn)行了檢測(cè)，特別是針對(duì)BDE-99進(jìn)行了研究，評(píng)估其對(duì)斑馬魚(yú)代謝以及相關(guān)甲狀腺素及甲狀腺激素脫碘酶Ⅲ(Dio3)的影響，探討了BDE-99對(duì)甲狀腺功能的影響，為今后對(duì)PBDEs的研究提供了參考，BDE-99和BDE-47的化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)中BDE-99和BDE-47以及甲狀腺激素中三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The chemical structural formulas of BDE-99 and BDE-47 of polybrominated diphenyl ethers and T3 (triiodothyronine) and T4 (tetraiodothyronine) of thyroid hormones

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 斑馬魚(yú)胚胎收集

成年AB系斑馬魚(yú)(Daniorerio)，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行繁育(北京愛(ài)生科技發(fā)展公司)，雌雄魚(yú)分開(kāi)飼喂，每天14 h∶10 h的光∶暗周期。養(yǎng)殖溫度(28±1) ℃，pH保持在7.0～7.6之間，電導(dǎo)率保持在440～640 μS之間。實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選出優(yōu)質(zhì)健康的性成熟斑馬魚(yú)，按照雌雄斑馬魚(yú)1∶2的比例放入交配缸中，待第2天早上開(kāi)燈，斑馬魚(yú)見(jiàn)光后開(kāi)始產(chǎn)卵，并收集胚胎，放入斑馬魚(yú)培養(yǎng)液(ZR液)中，并放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化。

1.2 粉塵樣品收集與處理

在2018年5—10月收集并處理企業(yè)辦公室(電腦較多)和家庭(沒(méi)有電腦)中4個(gè)地點(diǎn)(辦公室桌面、辦公室地面、家庭桌面和家庭地面)的室內(nèi)灰塵樣品[14](n=80)，并且灰塵收集在纖維素套管中[15]。除取樣地點(diǎn)不同外，其他取樣條件均保持一致。樣品過(guò)篩至500 μm以下，并儲(chǔ)存在-20 ℃。用二氯甲烷和己烷(V∶V=50∶50)萃取約100 mg的粉塵，超聲處理后，萃取液使用氮?dú)獯蹈蓾饪s。一半萃取液通過(guò)GC/MS鑒定阻燃劑[14]；另一半蒸干使用100 μL二甲基亞砜(DMSO)(純度為99.5%，西格瑪)溶解定容用于生物監(jiān)控，DMSO最終濃度<0.1%。

1.3 GC-MS檢測(cè)

參考Fulton等[16]的方法，使用GC-MS檢測(cè)灰塵中BDE-99和BDE-47的含量，選擇辦公室和家庭中2個(gè)地點(diǎn)的灰塵進(jìn)行檢測(cè)。將灰塵萃取液重新溶于100 mL異辛烷中，并添加BDE-47和BDE-99作為回收率測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品。使用配有HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)的Agilent 6850 GC和Agilent 5975C MS進(jìn)行樣品分析。使用氦氣作為載氣，以脈沖不分流模式進(jìn)樣1 mL樣品。最初將GC柱箱設(shè)置為80 ℃，以20 ℃·min-1的速度升至100 ℃，保持2 min。然后，將烤箱以30 ℃·min-1的速度加熱到220 ℃，再將速率降低到1 ℃·min-1，直到溫度達(dá)到225 ℃，并在其中保持5 min。然后以5 ℃·min-1的速度將溫度升至280 ℃，并且以20 ℃·min-1的速率達(dá)到300 ℃，此時(shí)為最終溫度，保持3 min。入口溫度為260 ℃，離子源和四重離子均設(shè)置為150 ℃。最終通過(guò)色譜圖分析所得數(shù)據(jù)。

1.4 暴露方法

暴露溶液用魚(yú)類養(yǎng)殖系統(tǒng)水對(duì)原液進(jìn)行稀釋獲得。魚(yú)類養(yǎng)殖系統(tǒng)水為空白對(duì)照組，濃度為100 nmol·L-1的BDE-99作為陽(yáng)性對(duì)照組，4個(gè)不同地點(diǎn)的灰塵萃取液為實(shí)驗(yàn)組。暴露試驗(yàn)在六孔板中進(jìn)行，每孔放入正常斑馬魚(yú)胚胎10粒，并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱(Heratherm IGS180, Thermo Fisher Scientific)中培養(yǎng)，每組進(jìn)行5次以上的重復(fù)試驗(yàn)。暴露時(shí)間為4～36 hpf，觀察斑馬魚(yú)胚胎眼部色素強(qiáng)度變化，用ImageJ對(duì)眼部色素沉著水平進(jìn)行量化。

1.5 BDE-99在斑馬魚(yú)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化檢測(cè)

收集經(jīng)100 nmol·L-1BDE-99暴露后的斑馬魚(yú)胚胎(幼魚(yú))和經(jīng)暴露后的幼魚(yú)長(zhǎng)成的成年魚(yú)，解剖取出成年魚(yú)肝臟，利用GC-MS檢測(cè)24 hpf、48 hpf、96 hpf和10 dpf斑馬魚(yú)胚胎(幼魚(yú))和成年魚(yú)肝臟體內(nèi)的BDE-99和BDE-47的含量。

1.6 整體原位雜交

當(dāng)斑馬魚(yú)胚胎達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要的發(fā)育階段，將其固定在含4%(w/V)多聚甲醛(分析純，純度為98.5%，福晨化學(xué))的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中(pH 7.4)過(guò)夜，之后用PBS清洗后浸泡于100%甲醇中，可放置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存。整體原位雜交(WISH)是按照Dong等[17]方法進(jìn)行的?；驹硎前唏R魚(yú)胚胎與809個(gè)堿基對(duì)的斑馬魚(yú)Dio3的反義雜交鏈結(jié)合。然后使用以下引物進(jìn)行克隆并且做Dio3探針(正向引物5’-TAGACGTGCAGCACCGCGGA-3’；反向引物5’-CGCTCCAGCCAGTCTCTGAG-3’)，在64 ℃雜交過(guò)夜后，胚胎用2×SSC(300 mmol·L-1NaCl，30 mmol·L-1檸檬酸鈉，pH 7.0)洗3次，然后用0.2×SSC洗3次，每次30 min。接下來(lái)的胚胎是用2%的封閉劑封閉(Roche公司，德國(guó))。然后在4 ℃用3 000×稀釋的DIG抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)(Roche公司，德國(guó))；最后，與BM-Purple底物(Roche公司，德國(guó))發(fā)色。

1.7 總RNA提取、cDNA生成和熒光定量PCR

使用TRIzol試劑處理完整的胚胎，從整體斑馬魚(yú)胚胎中提取總RNA，使用Nano Drop2000測(cè)定提取的總RNA濃度。純化的總RNA立即用于cDNA合成。cDNA的產(chǎn)生用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems Inc.)完成，反應(yīng)方法按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，cDNA樣本使用前將其保持在-20 ℃冷凍。使用TaqMan進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定和基因表達(dá)分析(Applied Biosystems Inc.；4331182)。反轉(zhuǎn)錄加入0.2 ng cDNA后進(jìn)行反應(yīng)，與TaqMan Universal PCR Master Mix混合，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7900HT, Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行PCR檢測(cè)，用Sequence Detection System 2.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)方法與步驟基本與Dong等[17]描述的相同。樣品的Dio3基因(正向引物5’-AGATGTTCACGCTGGAGTCG-3’，反向引物5’-CGAAGTTGAGGATCAGCGGT-3’)表達(dá)數(shù)據(jù)使用18s RNA作為內(nèi)參基因(正向引物5’-TCGCTAGTTGGCATCGTTTATG-3’，反向引物5’-CGGAGGTTCGAAGACGATCA-3’)，來(lái)補(bǔ)償在胚胎之間RNA量的內(nèi)在變異性。

1.8 ELISA法檢測(cè)TT3和TT4水平

挑選出4 hpf的斑馬魚(yú)胚胎，經(jīng)不同濃度的BDE-99暴露至72 hpf，收集0 (對(duì)照)、1、10、50和100 nmol·L-1濃度組胚胎各10粒，每個(gè)濃度組設(shè)立3個(gè)重復(fù)。用去離子水清洗，棄掉清洗液后，稱重，按照每組魚(yú)的質(zhì)量與PBS(pH=7.2)體積比為1∶20的比例，加入PBS，在0 ℃下進(jìn)行勻漿，勻漿后在10 000 r·min-1、4 ℃離心5 min，取上清液，用Elisa試劑盒(上海圻明生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)斑馬魚(yú)體內(nèi)總T3(total T3, TT3)和總T4(total T4, TT4)的含量[18]。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有表達(dá)數(shù)據(jù)均表示為平均值±SEM，使用GraphPad Prism software進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。差異顯著性使用單因素方差分析。P<0.05的情況下被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 辦公室及家庭灰塵中PBDEs的化學(xué)檢測(cè)

BDE-99和BDE-47的檢出率都是100%，但檢出濃度范圍較大。BDE-99在辦公室和家庭中的檢出濃度分別為0.01～159.32 ng·g-1和0.06～49.32 ng·g-1，中間值濃度分別為6.275 ng·g-1和1.835 ng·g-1，BDE-47在辦公室和家庭中的檢出濃度分別為0.01～148.32 ng·g-1和0.04～49.21 ng·g-1，中間值濃度分別是2.090 ng·g-1和1.860 ng·g-1。結(jié)果表明，BDE-99比BDE-47有更高的濃度殘留，辦公室比家庭有更高的殘存(圖2)?？紤]到可能是辦公室的電腦產(chǎn)品比家庭的多，造成了更多的阻燃劑殘留。

圖2 BDE-99和BDE-47在辦公室和家庭的灰塵中的濃度Fig. 2 BDE-99 and BDE-47 concentrations in offices and homes dust

2.2 灰塵中PBDEs毒性效應(yīng)的初期生物學(xué)檢測(cè)

筆者先前的研究結(jié)果表明[19]，選擇眼部作為評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，BDE-99能夠引起36 hpf斑馬魚(yú)胚胎整體色素的降低。同樣地，使用灰塵提取物經(jīng)過(guò)100×稀釋后，斑馬魚(yú)胚胎暴露于灰塵提取物組與BDE-99陽(yáng)性對(duì)照組相似，在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育到36 hpf時(shí)，斑馬魚(yú)胚胎眼部色素的沉著顯著降低(圖3(f)和3(g))。這說(shuō)明，使用生物學(xué)方法可以進(jìn)行PBDEs的初期高通量篩選。

圖3 灰塵提取物降低斑馬魚(yú)眼睛色素沉著強(qiáng)度注：胚胎暴露于灰塵提取物和BDE-99 (4～36 hpf)；用ImageJ對(duì)眼部色素沉著水平進(jìn)行量化；(a)對(duì)照組，(d) BDE-99陽(yáng)性暴露組，(b)、(c)、(e)和(f)灰塵提取物暴露組，其中，(b)和(c)分別為家庭中地面和桌面的灰塵提取物暴露組，(e)和(f)分別為辦公室地面和桌面(電腦附近)的灰塵提取物暴露組，(g)胚胎的色素強(qiáng)度柱狀圖(每組20個(gè)胚胎)，*表示與對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)，比例尺為100 μm，×100為稀釋100倍。Fig. 3 Dust extract reduces eye pigmentation intensity of zebrafishNote: The embryo was exposed to dust extract and BDE-99 (4～36 hpf); ImageJ was used to quantify the level of eye pigmentation; (a) control group; (d) BDE-99 positive exposure group; (b), (c), (e) and (f) dust extract exposure group, where (b) and (c) are the ground and desktop dust extract exposure group in the family, (e) and (f) are respectively exposure group of dust extracts on office floor and desktop (near computer); (g) is the histogram of the pigment intensity of embryos (20 embryos per group); *indicates a significant difference from the control group (P<0.05); the scale bar is 100 μm; ×100 means 100 times dilution.

2.3 BDE-99在斑馬魚(yú)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化

PBDEs在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)被代謝，BDE-99在灰塵中的檢出率達(dá)100%，而B(niǎo)DE-99在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)過(guò)脫溴作用主要降解為BDE-47[20]。使用GC-MS檢測(cè)了BDE-99在不同發(fā)育階段斑馬魚(yú)體內(nèi)的分解代謝情況。試驗(yàn)分別檢測(cè)了24 hpf、48 hpf、96 hpf和10 dpf斑馬魚(yú)胚胎(幼魚(yú))和成年魚(yú)肝臟中BDE-99的降解情況，結(jié)果表明，24 hpf和48 hpf時(shí)，無(wú)明顯降解，BDE-47也沒(méi)有被明顯檢測(cè)到(圖4)，這說(shuō)明，斑馬魚(yú)胚胎在此時(shí)期對(duì)BDE-99幾乎無(wú)降解作用。進(jìn)而推測(cè)灰塵萃取液對(duì)36 hpf斑馬魚(yú)胚胎色素的降低作用可能主要由BDE-99引起，而非BDE-47。

圖4 斑馬魚(yú)胚胎(幼魚(yú))和成年魚(yú)肝臟中BDE-99的降解注：將不同發(fā)育時(shí)期(24 hpf、48 hpf、96 hpf和10 dpf)斑馬魚(yú)(或者成年魚(yú)肝臟)制成勻漿，提取溶酶體后作用于BDE-99，然后使用GC-MS檢測(cè)BDE-99和BDE-47的含量；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Fig. 4 Zebrafish embryo (juvenile fish) and adult fish liver degrading BDE-99Note: Zebrafish at different developmental stages (24 hpf, 48 hpf, 96 hpf and 10 dpf) or adult fish liver are made into a homogenate, and lysosomes are extracted and then applied to BDE-99; the content of BDE-47 and BDE-99 are detected by GC-MS; the different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.4 BDE-99對(duì)Dio3基因表達(dá)的影響

為考察BDE-99對(duì)斑馬魚(yú)胚胎Dio3的影響，將4 hpf斑馬魚(yú)胚胎暴露于BDE-99溶液中直至胚胎發(fā)育到22 hpf和72 hpf。采用WISH和RT-PCR方法檢測(cè)了Dio3 mRNA的表達(dá)。WISH方法的檢測(cè)結(jié)果證明了暴露于1、10、50和100 nmol·L-1BDE-99的斑馬魚(yú)胚胎，其Dio3 mRNA表達(dá)有增加趨勢(shì)，表達(dá)位置主要位于原腎管部位(圖5(a)～5(e))。RT-PCR定量檢測(cè)結(jié)果表明，Dio3 mRNA表達(dá)隨BDE-99暴露濃度的增加而升高(1、10、50和100 nmol·L-1)。22 hpf時(shí)，BDE-99表現(xiàn)為誘導(dǎo)Dio3 mRNA表達(dá)的提高(圖6(a))，暴露于10、50和100 nmol·L-1BDE-99后的斑馬魚(yú)胚胎，Dio3 mRNA表達(dá)均升高了2.47倍以上(P<0.05)。72 hpf時(shí)，暴露于BDE-99的斑馬魚(yú)胚胎，Dio3 mRNA表達(dá)隨著濃度增加(1、10、50和100 nmol·L-1)均升高了1.64倍以上(圖6(b))，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著(P>0.05)。

圖5 Dio3基因表達(dá)在斑馬魚(yú)胚胎原腎管部位注：胚胎在4～22 hpf暴露于BDE-99；藍(lán)色部位是Dio3表達(dá)部位；比例尺為100 μm。Fig. 5 Dio3 gene is expressed in the protorenal duct of the zebrafish embryoNote: Embryos were exposed to BDE-99 from 4 to 22 hpf; the blue part is the Dio3 gene expression part; bar=100 μm.

圖6 BDE-99上調(diào)了斑馬魚(yú)胚胎 Dio3 mRNA表達(dá)注：斑馬魚(yú)胚胎暴露于0(對(duì)照)、1、10、50和100 nmol·L-1的BDE-99，當(dāng)胚胎發(fā)育到22 hpf和72 hpf時(shí)，使用RT-PCR檢測(cè)Dio3 mRNA表達(dá)；每組包含10個(gè)胚胎，每組3個(gè)重復(fù)；不同的字母表示顯著差異(平均值±SEM，P<0.05)。Fig. 6 BDE-99 up-regulated the expression of Dio3 mRNA in zebrafish embryosNote: Zebrafish embryos were exposed to BDE-99 at 0 (control), 1, 10, 50 and 100 nmol·L-1; when the embryos reached 22 hpf and 72 hpf, RT-PCR was used to detect Dio3 mRNA expression; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; different letters indicate significant differences (mean±SEM, P<0.05).

2.5 BDE-99對(duì)甲狀腺素的影響

斑馬魚(yú)胚胎在經(jīng)過(guò)1、10、50和100 nmol·L-1濃度的BDE-99處理后，在72 hpf進(jìn)行甲狀腺素TT3和TT4的檢測(cè)。與對(duì)照組相比，TT3含量在10、50和100 nmol·L-1濃度組都有顯著降低，分別降低至對(duì)照組的81%、79%和73% (P<0.05) (圖7(a))，TT4含量在50 nmol·L-1和100 nmol·L-1濃度組都顯著降低，分別降低至對(duì)照的84%和85%(圖7(b))。

圖7 BDE-99降低斑馬魚(yú)體內(nèi)總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)和總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)含量注：斑馬魚(yú)胚胎暴露于0(對(duì)照)、1、10、50和100 nmol·L-1的BDE-99；使用Elisa法檢測(cè)72 hpf斑馬魚(yú)胚胎的甲狀腺素含量；每組包含10個(gè)胚胎，每組3個(gè)重復(fù)；不同的字母表示顯著差異(平均值±SEM；P<0.05)。Fig. 7 BDE-99 reduces the content of total triiodothyronine (TT3) and total tetraiodothyronine (TT4) in zebrafishNote: Zebrafish embryos were exposed to BDE-99 at 0 (control), 1, 10, 50, and 100 nmol·L-1; the thyroxine content of 72 hpf zebrafish embryos was measured using the Elisa method; each group contains 10 embryos, with 3 replicates in each group; different letters indicate significant differences (mean±SEM; P<0.05).

3 討論(Discussion)

本研究結(jié)果表明，在灰塵中含有BDE-99和BDE-47，且BDE-99的含量大于BDE-47，且辦公室灰塵中的BDE-99和BDE-47含量比家庭中的多，可能是由于辦公室的電腦產(chǎn)品比家庭應(yīng)用得更多，電腦附近會(huì)釋放更多的BDE-99和BDE-47。將斑馬魚(yú)胚胎暴露于辦公室和家庭灰塵的萃取液中，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)眼部色素沉著減少，與BDE-99有著相似的現(xiàn)象。已知BDE-99在動(dòng)物體內(nèi)能夠降解為BDE-47，GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)的BDE-99在24 hpf和48 hpf基本無(wú)降解，也沒(méi)有明顯檢測(cè)到BDE-47，進(jìn)一步說(shuō)明灰塵萃取液對(duì)36 hpf斑馬魚(yú)胚胎色素的降低作用主要是BDE-99引起的。將斑馬魚(yú)胚胎暴露于BDE-99，結(jié)果顯示，Dio3表達(dá)量升高，TT3和TT4含量降低，這表明，BDE-99會(huì)增強(qiáng)Dio3活性，Dio3會(huì)介導(dǎo)甲狀腺激素的調(diào)節(jié)，Dio3 mRNA表達(dá)量升高導(dǎo)致甲狀腺激素分泌減少，對(duì)機(jī)體代謝造成影響。

Wang等[21]在90%的房屋粉塵中，檢測(cè)到BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-18和BDE-209，其中，BDE-209居多。本研究也在灰塵中檢測(cè)到了BDE-47和BDE-99。Li等[22]在研究中提到，舊計(jì)算機(jī)相較于新計(jì)算機(jī)會(huì)釋放更多的PBDEs。Zheng等[23]在手機(jī)和個(gè)人計(jì)算機(jī)表面檢測(cè)到BDE-209。Lee等[24]的定量物質(zhì)流分析結(jié)果顯示，電視和電腦顯示器中含有大量的PBDEs。這表明，電子產(chǎn)品會(huì)釋放更多的PBDEs，本研究也有證實(shí)了這一點(diǎn)。

色素沉積的降低與甲狀腺激素脫碘酶有一定關(guān)聯(lián)，本研究結(jié)果也證實(shí)了BDE-99會(huì)造成Dio3 mRNA表達(dá)量的升高，這可能是眼部色素沉著降低的原因之一。當(dāng)非洲爪蟾暴露于C-BDE-99(特定放射性49 Ci，即1 813 GBq·(mol·L-1)-1與BDE-99)，1.5 d后在視網(wǎng)膜黑色素層中發(fā)現(xiàn)了放射性物質(zhì)，表明眼部區(qū)域已經(jīng)有BDE-99累積，導(dǎo)致色素沉著的降低[25]。Yoo等[26]的研究結(jié)果表明，甲狀腺激素通過(guò)分泌黑素細(xì)胞刺激素(MSH)參與黑色素的合成和色素細(xì)胞活力的調(diào)節(jié)，在控制正常色素的形成中起著重要作用。色素沉著的機(jī)理很大程度上取決于甲狀腺激素。Dong等[27]使用6-羥基-四溴聯(lián)苯醚(6-OH-BDE-47)對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn)6-OH-BDE-47會(huì)誘導(dǎo)Dio3 mRNA表達(dá)升高。Wang等[28]的研究結(jié)果表明，BDE-47顯著增加了Dio1和Dio3的表達(dá)，并導(dǎo)致T4和T3的水平降低，表明Dio1和Dio3在BDE-47誘導(dǎo)的甲狀腺激素代謝中具有重要作用。在本研究中，BDE-99造成斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)Dio3表達(dá)量升高，TT3和TT4含量降低，進(jìn)而導(dǎo)致BDE-99對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)生影響，也進(jìn)一步證實(shí)了Dio3與機(jī)體代謝之間的聯(lián)系。

綜上所述，室內(nèi)灰塵中含有BDE-99和BDE-47，而電子產(chǎn)品會(huì)產(chǎn)生更多的BDE-99和BDE-47，暴露于BDE-99會(huì)造成斑馬魚(yú)胚胎中Dio3 mRNA表達(dá)量升高，進(jìn)而使TT3和TT4含量降低，這可能是由于BDE-99對(duì)Dio3有誘導(dǎo)作用，影響Dio3活性，從而造成甲狀腺功能的調(diào)節(jié)紊亂，影響機(jī)體代謝。

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