外泌體在肩袖損傷修復(fù)中的作用

王凱，李卓揚(yáng)，林向進(jìn)

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310003）

肩袖損傷是臨床常見的肩關(guān)節(jié)疾病之一，由內(nèi)在和外在因素引起[1]。肩袖損傷如未及時(shí)治療，受損肌腱會(huì)繼發(fā)變形和萎縮，造成永久性功能障礙。肩袖中肌腱-骨骼的特殊連接結(jié)構(gòu)被稱為“腱骨結(jié)構(gòu)”，此結(jié)構(gòu)從軟腱組織到硬骨骼分為四個(gè)過渡梯度[2]：肌腱、非礦化的纖維軟骨、礦化的纖維軟骨和骨骼。四個(gè)梯度礦化程度逐漸增加，肌膠原纖維逐漸減少。腱骨結(jié)構(gòu)將機(jī)械應(yīng)變沿著過渡方向分布，以加強(qiáng)肌腱和骨骼之間的結(jié)合[3]。肩袖損傷后腱骨結(jié)構(gòu)的修復(fù)是通過瘢痕組織形成而不是原有結(jié)構(gòu)再生[4]，新生的瘢痕組織缺乏礦物質(zhì)分布和膠原纖維組織梯度導(dǎo)致腱骨結(jié)構(gòu)抗張能力變?nèi)酰菀装l(fā)生肌腱二次撕裂[5]。近年來，臨床上對(duì)肩袖損傷修復(fù)的改進(jìn)集中在手術(shù)和縫合技術(shù)上，對(duì)腱骨結(jié)構(gòu)再生尚無策略，因此收效不甚理想。然而近期有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在肩袖損傷的病理刺激下（包括缺氧）可以觸發(fā)外泌體釋放，攜帶再生介質(zhì)至細(xì)胞外基質(zhì)，保護(hù)肌腱基質(zhì)免受損傷[6]。腱骨愈合是肩袖損傷修復(fù)的關(guān)鍵，盡管已有研究表明，外泌體在肩袖損傷修復(fù)中的積極作用，但目前的研究尚處于早期階段，作用機(jī)制仍不明確。本文將綜述外泌體在肩袖損傷領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展，發(fā)掘其在肩袖修復(fù)中的潛力。

1 外泌體的結(jié)構(gòu)

外泌體（exosomes）是細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一種，Johnstone 等[7]最早于 1983 年在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是直徑為30～100nm的多形性囊泡樣小體。較大（直徑＞100nm）的微囊泡一般是細(xì)胞膜直接分離而來[8]，外泌體則首先由細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷形成胞內(nèi)小泡，內(nèi)含部分細(xì)胞質(zhì)，形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體逐漸成熟后選擇性地分揀胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，發(fā)育成晚期內(nèi)體后，其微粒體膜向內(nèi)出芽形成多囊泡內(nèi)體 （multivesicular body，MVB）。MVB形成后一般有兩種結(jié)局：與溶酶體膜融合后其內(nèi)容物被水解，以及與細(xì)胞膜融合后存在于多囊泡內(nèi)體中的囊泡被釋放到胞外，形成外泌體[9]。

外泌體可由癌癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和包括骨骼肌在內(nèi)的多種細(xì)胞等釋放[10]，是細(xì)胞內(nèi)通訊的高效載體，以自分泌或旁分泌的方式傳遞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA mRNA編碼的信息。產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞根據(jù)不同激活響應(yīng)和壓力誘導(dǎo)刺激而產(chǎn)生不同數(shù)量的外泌體，不同組織來源的外泌體釋放其獨(dú)特含量的信息來影響細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境[11]。在肌肉骨骼系統(tǒng)，外泌體多由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌釋放[12]，攜帶調(diào)節(jié)蛋白的mRNA，即miRNA，被傳遞到各種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞，以改善細(xì)胞表型和功能，參與各種生物學(xué)過程如免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和血管生成[13]。

在體內(nèi)，間充質(zhì)干細(xì)胞可存在于骨髓、脂肪組織、臍帶血、Wharton’s膠和滑囊液中[14]。 在特殊的微環(huán)境中，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠自我更新和分化為多種細(xì)胞表型，包括軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞和成骨細(xì)胞[15]，其以優(yōu)異的旁分泌、免疫調(diào)節(jié)和血管再生潛力誘導(dǎo)軟組織和硬組織（骨骼）的生長[16]。在肩袖損傷關(guān)節(jié)鏡修復(fù)手術(shù)中，鉚釘放置時(shí)可得到骨髓間間充質(zhì)干細(xì)胞[17]，有研究表明，將其應(yīng)用于肩袖撕裂修復(fù)時(shí)肌腱功能得到明顯改善[18]。Sevivas等[19]通過將MSCs（其中包含從MSCs釋放的細(xì)胞因子、生長因子和外泌體）和肌腱細(xì)胞共培育，證實(shí)了骨髓來源的MSCs在肩袖肌腱撕裂修復(fù)中的作用。體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為肌腱細(xì)胞密度和活力增加，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則表現(xiàn)出了更高的肌腱成熟度、斷裂伸長率和較低的硬度，改善了肩袖生物力學(xué)和組織學(xué)功能。Kim等[20]的研究比較了傳統(tǒng)肩袖損傷修復(fù)和注射脂肪來源MSCs修復(fù)的患者，在術(shù)后12個(gè)月的隨訪中，MSCs分泌物治療組的二次撕裂率顯著低于傳統(tǒng)治療組（14.3% VS 28.5%）。這些研究表明，MSCs分泌物可能通過調(diào)節(jié)局部免疫和生物活性環(huán)境使肌腱細(xì)胞增殖和分化，提高肌腱愈合程度，改善肩袖修復(fù)。

2 外泌體的釋放

人類活檢和動(dòng)物模型相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，缺氧是肩袖肌腱損傷病理學(xué)開始和進(jìn)展的主要誘因。一方面，肌腱組織的血管特性、極端缺氧觸發(fā)凋亡特性會(huì)加速肌腱細(xì)胞的壞死；另一方面，缺氧激發(fā)了HIF-1α介導(dǎo)的炎癥和修復(fù)反應(yīng)[21]。但同時(shí)，缺氧環(huán)境能夠促使MSCs和常駐肌腱干細(xì)胞的遷移和增殖，從而促進(jìn)肌腱愈合[22]，因此MSCs外泌體（MSCs-exos）是聯(lián)系受損組織細(xì)胞和周圍MSCs、啟動(dòng)組織再生的關(guān)鍵介質(zhì)[23]。Hu等[24]進(jìn)一步證明了低氧下外泌體的釋放，以劑量依賴的方式觸發(fā)了鄰近成纖維細(xì)胞群上調(diào)I型膠原蛋白的合成并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑和局部組織修復(fù)。由此推斷，肩袖肌腱撕裂造成了局部低氧環(huán)境，誘導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的釋放，包含蛋白信息的外泌體至細(xì)胞外基質(zhì)，保護(hù)肌腱組織免受損傷并加速組織再生反應(yīng)。

3 外泌體在肩袖損傷修復(fù)中的作用

3.1 對(duì)血管生成的作用 外泌體釋放的促血管生成因子包括：促血管生成因子，包括肝素結(jié)合性生長因子（HBEGF）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白（NT-3）、血小板衍生生長因子（PDGF-ββ）、胎盤生長因子（PLGF）、干細(xì)胞因子（SCF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）等，以及血管生長因子，包括粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR2）等[25]。綜合許多研究證明，脂肪來源的MSCs-exos釋放的因子不僅會(huì)引起現(xiàn)有血管舒張[26]，還將作用于肩袖損傷修復(fù)后組織的血運(yùn)重建[25]，提供更好的組織灌注，加速傷口愈合最終降低二次撕裂風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 對(duì)瘢痕形成的作用 瘢痕組織由于膠原纖維的紊亂和錯(cuò)位，導(dǎo)致新生傷口愈合功能喪失[27]。Wang等[28]分析了小鼠模型中靜脈注射脂肪來源MSCs-exos瘢痕組織愈合的影響，結(jié)果顯示，MSCsexos減少了瘢痕面積，增加了Ⅲ型膠原/Ⅰ型膠原的比例，TGF-β3與TGF-β1的比例也提高，這正是膠原形成的重要信號(hào)。此外還觀察到基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）的組織抑制劑水平上調(diào)，從而提高了細(xì)胞外基質(zhì)重塑并抑制了瘢痕組織形成。對(duì)MMPs和外泌體的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，許多外泌體攜帶MMP9，MMP9可促進(jìn)膠原基質(zhì)從層狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向纖維狀結(jié)構(gòu)[29]，同樣證實(shí)了外泌體對(duì)瘢痕組織形成的影響[30]。

3.3 對(duì)炎性反應(yīng)的作用 人體滑囊液中分離出的外泌體具有骨關(guān)節(jié)炎特有的miRNA譜，滑膜成纖維細(xì)胞分泌的外泌體被關(guān)節(jié)軟骨吸收，并誘導(dǎo)一系列病理變化和分子變化，例如細(xì)胞外基質(zhì)合成基因（ACAN）和Ⅱ型膠原α1（COL2A1）的下調(diào)[31]，基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）和金屬蛋白酶5（ADAMTS-5）的上調(diào)[32]，以及IL-6的產(chǎn)生[31]。有趣的是，與滑囊液中分離出的外泌體相比，MSCs-exos似乎發(fā)揮了相反作用，如通過增加軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分（即Ⅱ型膠原蛋白，軟骨寡聚基質(zhì)蛋白）的產(chǎn)生來維持軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成降解平衡[33]，甚至加速軟骨修復(fù)[34]。除了維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡外，其攜帶的Wnt家族成員5a/5b還激活了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，靶向下游YAP蛋白途徑，以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而減緩早期骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，防止對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨的嚴(yán)重?fù)p害[35]。

3.4 對(duì)肌肉變性的作用 Bier等[36]研究了胎盤來源的MSCs-exos對(duì) Duchenne肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）患者成肌細(xì)胞和小鼠成肌細(xì)胞的影響，證明外泌體有助于緩解肌肉變性退化。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MSCs-exos增加了體外成肌細(xì)胞分化，抑制了DMD成肌細(xì)胞特征性的纖維蛋白原基因表達(dá)，提高了肌肉發(fā)育高水平表達(dá)的卵磷脂含量[37]。小鼠肌內(nèi)移植MSCs-exos同樣出現(xiàn)了卵磷脂表達(dá)增加，并減少肌酸肝激酶表達(dá)，降低心肌和膈肌TGF-β的水平和纖維化，抑制炎癥反應(yīng)等[36]。

4 作為載體材料的應(yīng)用

外泌體可以攜帶受體細(xì)胞攝取的各種核酸和蛋白質(zhì)，因此它們是理想的藥物載體。具有毒性或免疫原性的藥物可以封裝在外泌體中靶向運(yùn)送至目標(biāo)細(xì)胞，以避免全身毒性，如Pascucci等[38]在外泌體中裝載了紫杉醇遞送至耐藥細(xì)胞，使細(xì)胞毒性增加50倍以上。另有一項(xiàng)研究使用了MSCs-exs裝載的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）治療缺血性心臟病[39]，在大鼠模型中，該組顯著增加了心肌中EPCs的植入量和存活率，明顯改善了左室舒張末功能。盡管目前尚無 MSCs-exos裝載體治療肌腱撕裂的動(dòng)物模型或人體相關(guān)試驗(yàn)，但有限的研究給未來治療肩袖損傷降低二次撕裂風(fēng)險(xiǎn)提供了新思路。

5 結(jié)論與展望

盡管手術(shù)和縫合技術(shù)不斷改進(jìn)，對(duì)肩袖損傷修復(fù)的認(rèn)識(shí)不斷深入，但其較低的手術(shù)成功率和二次撕裂的高風(fēng)險(xiǎn)仍然是臨床上的難題，包括近年來出現(xiàn)的一些修補(bǔ)或支架材料，都難以達(dá)到減輕患者疼痛、恢復(fù)肌腱功能的要求。外泌體作為細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分在促進(jìn)血管生成、抑制瘢痕組織形成、抑制炎癥免疫反應(yīng)、減緩肌肉變性退化等過程中扮演著重要角色。但目前外泌體對(duì)肩袖損傷愈合作用的研究尚處于早期階段，還需大規(guī)模隊(duì)列或前瞻性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。同時(shí)，外泌體展現(xiàn)了作為生物載體材料高循環(huán)穩(wěn)定性、高生物相容性、低免疫原性和低毒性的巨大優(yōu)勢，且其具有大規(guī)模生產(chǎn)和制造的可能性[40]，這些都為提高肩袖肌腱愈合再生提供了研究方向。