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    基于CUMS大鼠逍遙散拆方藥隊抗抑郁作用的BDNF通路分子機制研究

    2019-05-31 02:41:12賀欣雨王學石博宇羅杰劉小波彭希曾南劉蓉
    中藥與臨床 2019年1期
    關鍵詞:方藥皮層抗抑郁

    賀欣雨,王學,石博宇,羅杰,劉小波,彭希,曾南,劉蓉

    逍遙散源于《太平惠民和劑局方》,具有調(diào)和肝脾、養(yǎng)血健脾、疏肝解郁之功效,是疏肝解郁的代表方劑[1]。實驗研究與臨床應用均證實逍遙散抗抑郁作用確切。課題組前期采用“功效拆方”研究模式將逍遙散拆分為疏肝藥(柴胡+薄荷)、養(yǎng)血藥(當歸+白芍)、疏肝藥+健脾藥(白術+茯苓+生姜+炙甘草)、養(yǎng)血藥+健脾藥藥隊組別,發(fā)現(xiàn)逍遙散疏肝藥隊、養(yǎng)血藥隊能明顯改善CUMS模型大鼠抑郁樣行為,認為柴胡、當歸、白芍及薄荷是逍遙散全方發(fā)揮抗抑郁作用的主要功效藥隊[2];在“功效拆方”研究基礎上,通過小鼠FST、TST實驗進行4味藥物最佳配伍比例篩選,獲得由柴胡、當歸、薄荷3味藥物組成的精簡有效藥隊(逍遙散拆方藥隊),具有與全方相當?shù)目挂钟糇饔帽憩F(xiàn)[3]。本研究以慢性不可預知溫和應激(CUMS)大鼠模型為載體,基于前期藥效學的研究基礎,即該藥隊能有效改善CUMS大鼠的抑郁樣行為,明顯提高大鼠血清與腦組織中腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)水平,降低ACTH、Cort濃度[4],著重采用分子生物學方法測定CUMS大鼠皮層、海馬部位BDNF通路相關分子的基因與蛋白表達水平,有效證實其抗抑郁作用發(fā)揮與干預BDNF通路的關系。

    1 材料

    1.1 實驗藥物

    逍遙散全方與逍遙散拆方藥隊中當歸、白芍、茯苓、白術、生姜、薄荷、炙甘草購自成都太極大藥房;柴胡購自河北一仁藥業(yè)有限公司。各組藥物的制備方法與前期研究一致[4]。逍遙散全方藥液濃度為1.5 g生藥/mL,逍遙散拆方藥隊藥液濃度為0.765、0.575 g生藥/mL。實驗中逍遙散劑量沿用前期研究有效劑量30 g.kg-1(臨床劑量的30倍),逍遙散拆方藥隊依據(jù)前期研究中小鼠的有效劑量換算為大鼠的等效劑量,分別為15.33、11.5 g.kg-1。鹽酸阿米替林(amitriptyline hydrochloride,10 mg.kg-1),SIGMA公司,批號039K1600。

    1.2 實驗動物

    Wistar大鼠,SPF級,雄性,成都達碩生物科技有限公司提供,許可證號:SCXK(川)2015-030。

    1.3 實驗主要儀器

    ZHWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;MDF-U50V超低溫冰箱,日本 Sanyo 公司;SYNS00000純水儀,Millipore公司;UPT-2-5T超純水儀,成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司; DYY-6C電泳儀電源,北京市六一儀器廠;GELDOCEQ凝膠成像分析儀、iCycler iOMulticolor Real-Time PCR Dectection System、垂直式電泳儀、濕轉轉膜儀、Bio-Rad 小型垂直電泳槽、轉膜槽、Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)、Image Lab凝膠分析系統(tǒng),美國Bio-Rad公司。

    1.4 實驗主要試劑

    DEPC,AMRESCO公司,批號0855C144。AxyPrepTMMultisoure Total RNA Miniprep Kit 50-prep Nucleic Acid Purification Kit,AxyGEN公司,批號03415KD1。FastQuant RT Kit 100rxn(With gDNase)、SuperReal PreMixPlus20 μL*500 rxn (SYBR Green),TIANGEN公司,批號分別為P4318、 P4229。RIPA裂解液(強)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE)5×,碧云天生物技術研究所,批號分別是P0013B、P0010S、P0015L。β-Tubulin Rabbit mAb、 TrkB Rabbit mAb、CREB Rabbit mAb、 pCREB Rabbit mAb、Anti-rabbit IgG HRP-Linked Antibody,Cell Signaling公司,批號分別為#2128、#4603、#9197、#9198、#7074。BDNF Rabbit mAb,abcam公司,批號ab108319。

    2 實驗方法

    2.1 造模、分組與給藥

    取健康雄性Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)3天,按體重分層隨機分為6組:空白對照組及模型1-5組,模型組大鼠單只單籠飼養(yǎng),并施加CUMS程序進行造模,空白對照組大鼠合籠飼養(yǎng)不施加造模程序。造模前及開始造模后每周測定大鼠糖水偏好率,造模4周后,通過比較模型組大鼠造模前后糖水偏好率的變化差異,且出現(xiàn)自主活動減少行為,以評價大鼠模型是否成功。第5周將篩選合格的模型1-5組大鼠重新分為CUMS模型對照組、阿米替林組(10 mg.kg-1)、逍遙散全方組(30 g.kg-1)、逍遙散拆方藥隊15.33、11.5 g.kg-1劑量組,各組動物開始分別灌胃給予相應藥物,給藥體積2 mL/100g,每日一次,連續(xù)4周,空白對照組與模型對照組大鼠給予等體積蒸餾水,給藥期間模型組和所有藥物組大鼠持續(xù)造模[4]。CUMS程序刺激因子參見文獻選擇[2]。

    2.2 實時熒光定量PCR檢測CUMS大鼠海馬、皮層BDNF、TrkB、CREB mRNA表達水平

    各組大鼠給藥4周后進行行為學測試,測試結束后處死大鼠,迅速剝離大鼠全腦,在冰上分離取得大腦海馬、皮層組織,-80℃保存?zhèn)溆谩7謩e稱取大鼠海馬和皮層組織20~30 mg,置于冰上解凍,采用AxyGEN總RNA小量制備試劑盒提取樣本總RNA,并檢測RNA的純度及含量,按照Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA,運用RT-PCR法檢測BDNF、TrkB、CREB、GR mRNA的表達,各基因PCR反應程序如下:95 ℃ 15 min預變性;95℃ 10s變性及60.4℃(BDNF、TrkB)、62.4 ℃(β-actin、CREB)30s退火,39個循環(huán);65℃ 5 s采集熒光,共60個循環(huán),每循環(huán)溫度增加0.5℃至95℃。采用相對定量法,以β-actin基因為內(nèi)參基因,以樣本的平均Cq值作為校正值。依據(jù)公式F=2-△△Cq=2-(△1Cq-△2Cq),通過差異值反映逍遙散拆方藥隊對大鼠海馬、皮層組織各指標mRNA表達的影響。所有引物由invitrogen(上海)公司設計合成,基因引物堿基序列見表1。

    表1 基因引物序列

    2.3Western Blot法檢測CUMS大鼠皮層、海馬BDNF、TrkB、CREB、pCREB蛋白表達水平

    稱取40 mg左右的大鼠海馬或皮層組織,置于已滅菌烘干且用液氮預冷的的研缽中,加入液氮研成粉末狀,再加入 400 μL RIPA 裂解液研磨,充分研磨融解后將勻漿液轉移至1.5 mL EP管內(nèi),渦旋混勻,冰上放置直至充分裂解。4℃10000 g 離心 5 min,取上清,立即 用BCA 法測定樣本總蛋白含量,將所有樣本蛋白濃度調(diào)至等濃度。按WB法常規(guī)操作制備電泳樣本,進行電泳后采用濕法轉膜,轉膜后的PVDF膜用封閉液封閉2 h,取出至新的封閉袋中,加入一抗(兔源Anti-β-Tubulin antibody、Anti-BDNF antibody、Anti-TrkB antibody、Anti-CREB antibody、Anti-pCREB antibody均按1:1000稀釋),封口,4℃冰箱靜置過夜。孵育后取出漂洗,再加入二抗(HRP-山羊抗兔IgG按 1:1000稀釋)孵育1.5 h。取出PVDF膜漂洗后,顯色液顯色,ChemiDocTM XRS+Imaging System 凝膠掃描成像儀中掃描成像,運用Imade lab圖像分析系統(tǒng)分析條帶光密度值,采用目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-Tubulin條帶光密度值的比值作為目的蛋白的蛋白相對表達量進行統(tǒng)計。

    2. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    實驗所得數(shù)據(jù)均以x±s表示,均用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)秩和檢驗(Mann-Whitney U)分析。

    3 實驗結果

    3.1 CUMS大鼠海馬、皮層部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的相對表達量

    結果見表1、表2。與空白組比較,CUMS造模能顯著降低大鼠海馬、皮層BDNF、TrkB、CREB mRNA表達水平(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,逍遙散、逍遙散拆方藥隊11.5、15.33 g.kg-1劑量均明顯上調(diào)海馬部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的表達水平(P<0.05或P<0.01)。逍遙散對皮層部位TrkB mRNA的表達有上調(diào)作用(P<0.05);逍遙散拆方藥隊15.33 g.kg-1劑量能顯著上調(diào)皮層部位BDNF、TrkB、CREB mRNA的表達水平(P<0.01),逍遙散拆方藥隊11.5 g.kg-1劑量呈現(xiàn)一定上調(diào)趨勢(P>0.05)。

    表1 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB mRNA水平的影響(x±s)

    表2 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠皮層BDNF、TrkB、CREB mRNA水平的影響(x±s)

    注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

    3.2 CUMS大鼠海馬、皮層部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達水平

    結果見表3、表4,圖1。與空白組相比,CUMS程序造模能抑制大鼠海馬、皮層部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白的表達,降低CREB磷酸化水平(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,在海馬部位,逍遙散、逍遙散拆方藥隊11.5、15.33 g.kg-1劑量均明顯促進BDNF、TrkB蛋白的表達(P<0.05或P<0.01);逍遙散拆方藥隊11.5 g.kg-1劑量能提高CREB磷酸化水平(P<0.01),逍遙散、逍遙散拆方藥隊15.33 g.kg-1劑量對CREB磷酸化有一定促進作用。在皮層部位,逍遙散明顯促進CREB的磷酸化(P<0.01),對BDNF、TrkB蛋白的表達有提高趨勢;逍遙散拆方藥隊11.5 g.kg-1劑量明顯提高TrkB蛋白表達和CREB磷酸化水平(P<0.05或P<0.01),對BDNF蛋白表達的作用不明顯;逍遙散拆方藥隊15.33 g.kg-1劑量僅能顯著提高CREB的磷酸化水平(P<0.05),一定程度上調(diào)BDNF、TrkB蛋白表達。

    表3 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠海馬BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達的影響(x±s)

    表4 逍遙散拆方藥隊對CUMS大鼠皮層BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達的影響(x±s)

    圖1 CUMS大鼠海馬、皮質(zhì)部位BDNF、TrkB、CREB、pCREB 蛋白表達圖譜

    4 討論

    腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是腦內(nèi)最豐富的一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白,BDNF 對神經(jīng)元的生長、增殖、存活和突觸活動至關重要[5],在大腦皮層、海馬、嗅 球、基底前腦、中腦、下丘腦各個區(qū)域均能檢測到 BDNF 蛋白和 mRNA的表達[6]。BDNF 可通過促進神經(jīng)突觸生長而建立神經(jīng)元和靶細胞之間的突觸聯(lián)系[7],且能與其他主要神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)(包括谷氨酸能神經(jīng)系統(tǒng)、γ-氨基丁酸能神經(jīng)系統(tǒng)、血清素能神經(jīng)系統(tǒng)和多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng))相互作用而參與促進正常神經(jīng)系 統(tǒng)的發(fā)育[8~9],研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥自殺患者的海馬和前額葉皮層部位的 BDNF 水 平降低,但在接受抗抑郁藥物治療的受試者中未觀察到類似的 BDNF 降低現(xiàn)象[10]。此外,CUMS應激程序可引起動物海馬和前額葉皮層 BDNF mRNA和蛋白 表達明顯減少,抗抑郁藥物的治療則可增加這些大腦區(qū)域的 BDNF水平[11],目前認為 BDNF的減少是抑郁癥的發(fā)病機制之一。

    BDNF 作為中樞神經(jīng)級聯(lián)信號傳遞的關鍵分子,與抑郁癥的發(fā)生密切相關,是抗抑郁藥物治療的重要靶位,其功能的表達需要酪氨酸蛋白激酶 B(TrkB)參與。TrkB是受體酪氨酸激酶 Trk 家族的一員,為 BDNF 的特異性高親和力受體,能介導BDNF下游通路[12]。文獻報道抑郁樣模型動物及抑郁癥患者海馬 BDNF 及其受體 TrkB 的水平明顯降低,該表現(xiàn)可被抗抑郁藥逆轉[9,13]。BDNF 與 TrkB 結合致TrkB 酪氨酸殘基的自磷酸化,隨后通過 Ras-MEKMAPKERK1/2 或 PI3K-Akt 信號級聯(lián)激活環(huán)磷腺苷反應元件結合蛋白(CREB),促進 CREB 磷酸化[14]。CREB是腦內(nèi)重要的核轉錄因子,調(diào)節(jié)基因的表達,參與許 多與神經(jīng)保護相關的過程,活化的 CREB 能夠調(diào)控多種與神經(jīng)細胞再生、存活 密切相關的活性物質(zhì)的轉錄水平,包括 BDNF。抑郁患者的尸檢發(fā)現(xiàn),病人腦 內(nèi)不僅 BDNF 和其受體 TrkB mRNA 表達水平,而且 CREB、pERK1/2 和 ERK1/2 的 mRNA水平均明顯降低[15],相反患者若經(jīng)過抗抑郁治療后上述基因表達水平有所提高[16]。抑郁癥動物模型的研究亦表明,模型大鼠海馬區(qū) BDNF 表達明顯下調(diào),與 CREB 和 ERK1/2 的磷酸化水平降低有關[17]。

    本實驗表明,與空白組相比,CUMS 大鼠海馬與皮層部位 BDNF、TrkB、 CREB mRNA 和蛋白表達水平,以及 CREB 磷酸化程度均下調(diào),與該模型大鼠 前期研究發(fā)現(xiàn)的大鼠血清、海馬與皮層部位 BDNF 水平,以及血清 TrkB、 CREB 水平均明顯降低的結果相吻合[4],且與已有的抑郁樣動物和臨床抑郁癥患者研究的文獻報道相符,進一步證實了 BDNF 在抑郁癥發(fā)病機制與治療中的重 要地位,同時也提示本研究中模型動物的成功建立。與模型組比較,逍遙散、 逍遙散拆方藥隊 11.5、15.33 g.kg-1劑量連續(xù)給藥 4 周,均可提高 CUMS 大鼠中樞 BDNF、TrkB、CREB mRNA 和蛋白表達水平,并促進 CREB 磷酸化,其中在海馬部位的上調(diào)作用相對優(yōu)于皮質(zhì)部位,逍遙散、逍遙散拆方藥隊作用表現(xiàn) 基本一致;其次該實驗結果與前期直接測定CUMS 大鼠血清與中樞部位 BDNF、 TrkB、CREB水平的結果吻合[4],從分子水平上表明了逍遙散拆方藥隊及逍遙

    散全方能通過上調(diào) BDNF-TrkB-CREB 通路發(fā)揮抗抑郁作用,且提示逍遙散精簡藥方即逍遙散拆方藥隊的作用機制與表現(xiàn)類似全方,具有較好的應用價值,同時再次證實了 BDNF是逍遙散及其拆方藥隊抗抑郁作用發(fā)揮的重要靶點,但究 其如何影響Ras-MEK-MAPK-ERK1/2 或 PI3K-Akt 信號通路來促進 CREB 的磷 酸化尚待進一步探討。

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