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    牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性比較分析

    2021-06-30 13:56:46陳雪梅易川平王明秀鐘金城
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:絲裂霉素生精高糖

    陳雪梅, 易川平, 羅 輝, 張 鵬, 王明秀, 蔡 欣*, 鐘金城*

    (1. 西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都610041; 2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,綿陽(yáng) 621010)

    犏牛是牦牛與普通牛的雜交后代,在產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、役用能力和肉質(zhì)等性狀方面具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì),同時(shí)對(duì)青藏高原惡劣氣候環(huán)境有很好的適應(yīng)能力,但犏牛雄性不育極大限制了其在牦牛雜交育種中的有效利用。近年來(lái),犏牛雄性不育是研究的重點(diǎn),組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn),犏牛雄性不育主要表現(xiàn)在睪丸組織中精母細(xì)胞數(shù)量變少、曲細(xì)精管中極少見(jiàn)精子和減數(shù)分裂受阻[1]。陳會(huì)友等[2]綜述了DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等與犏牛不育的關(guān)系,從分子生物學(xué)水平總結(jié)了犏牛不育的原因。

    精子的發(fā)生是生精細(xì)胞在睪丸組織曲細(xì)精管內(nèi)一系列復(fù)雜的細(xì)胞增殖以及分化過(guò)程,是一個(gè)受高度調(diào)控的過(guò)程,主要包括精原細(xì)胞有絲分裂增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和單倍體精子形成3個(gè)階段[3]。睪丸細(xì)胞如生精細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均參與了精子發(fā)生過(guò)程[4]。睪丸支持細(xì)胞附著于生精小管基膜,其上黏附生精細(xì)胞,是與生精細(xì)胞唯一直接接觸的體細(xì)胞,作為生精細(xì)胞非常重要的微環(huán)境組成存在于精子發(fā)生的各個(gè)時(shí)期,在整個(gè)生精周期中具有舉足輕重的作用[5]。最新研究發(fā)現(xiàn),組蛋白修飾及甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)在牦牛與犏牛的生殖細(xì)胞及睪丸支持細(xì)胞中存在明顯差異[6],犏牛睪丸中與支持細(xì)胞發(fā)育及類固醇生成相關(guān)基因的低表達(dá)[7],提示犏牛睪丸支持細(xì)胞存在缺陷,然而,關(guān)于牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)、增殖特性、相關(guān)基因表達(dá)等,還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道,此部分的探索有利于進(jìn)一步揭示犏牛雄性不育的生理機(jī)制。飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C(化學(xué)方法)或射線(物理方法)處理后,細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂增殖卻依然保持著代謝活性,通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子和物理支持可以一定程度模擬細(xì)胞增殖的體內(nèi)環(huán)境,廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞及其他體外培養(yǎng)困難的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)[8]。睪丸支持細(xì)胞采用絲裂霉素C處理后可作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行精原干細(xì)胞體外培養(yǎng),可應(yīng)用于動(dòng)物繁殖、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備、雄性不育治療、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9-13]。

    為探究牦牛與F1雄性犏牛睪丸支持細(xì)胞的差異,本研究分離純化兩個(gè)牛種睪丸支持細(xì)胞并予以鑒定;篩選不同的培養(yǎng)基,構(gòu)建更適合的睪丸支持細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)體系;比較兩牛種睪丸支持細(xì)胞的體外增殖特性和標(biāo)志、功能基因的表達(dá)差異;通過(guò)不同濃度絲裂霉素C處理兩種牛的支持細(xì)胞,評(píng)價(jià)其針對(duì)絲裂霉素C處理的耐受特性。從睪丸支持細(xì)胞角度分析犏牛雄性不育的相關(guān)原因,為進(jìn)一步探究犏牛雄性不育提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,美國(guó)),倒置熒光顯微鏡(Zeiss,德國(guó)),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國(guó)),細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(JIMBIO,中國(guó)),全功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek,美國(guó)),特級(jí)胎牛血清(Clark,美國(guó)),DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó)),DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco,美國(guó)),胰蛋白酶(Gibco,美國(guó)),堿性磷酸酶染液(索萊寶,中國(guó)),油紅O染色液(索萊寶,中國(guó)),絲裂霉素C(MCE,中國(guó)),CCK8試劑(同仁,日本),GATA-4抗體(Santa Cruz,日本)。

    1.2 牦牛及犏牛睪丸組織取材及組織凍存

    在四川省阿壩州紅原縣采集24月齡3頭健康公麥洼牦牛及3頭F1公犏牛的睪丸組織,用含雙抗的PBS溶液清洗后,去除睪丸白膜,將其剪至為6 mm3大小的組織塊,加入冷凍保護(hù)液(10%DMSO+10%胎牛血清+80%完全培養(yǎng)基)浸泡組織塊,室溫處理5 min后,放入液氮中保存,樣本分為牦牛與F1犏牛兩個(gè)組,每組3個(gè)重復(fù),液氮轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    1.3 牦牛及犏牛睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)

    從液氮中取出凍存的睪丸組織約0.5 g,37 ℃水浴處理2 min,待組織融化后用鑷子取出,置于復(fù)蘇液中(DMEM高糖培養(yǎng)基+0.5 mol·L-1蔗糖+20%FBS),37 ℃水浴放置2 min,預(yù)熱PBS洗滌組織塊2~3次, 組織塊置于DMEM高糖培養(yǎng)基中,用眼科剪剪碎組織,加入終濃度為1 mg·mL-1的Ⅳ型膠原酶及0.5 μg·mL-1的DNase I,37 ℃震蕩水浴消化組織30~40 min,鏡下見(jiàn)為單個(gè)細(xì)胞懸液,加入胎牛血清終止消化,混合細(xì)胞懸液吹打均勻后,依次經(jīng)70 μm與40 μm篩網(wǎng)過(guò)濾,收集濾液經(jīng)300×g4 ℃離心5 min,棄上清,完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,37 ℃, 5% CO2培養(yǎng),取部分細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,自動(dòng)計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞活率?;旌霞?xì)胞懸液培養(yǎng)24 h差速貼壁后,移去上清液,并加入PBS盡量洗棄懸浮的生精細(xì)胞,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓處理24 h, 37 ℃,5% CO2培養(yǎng),換液加完全培養(yǎng)基,鏡下觀察記錄細(xì)胞增殖生長(zhǎng)過(guò)程。

    1.4 睪丸支持細(xì)胞的鑒定

    1.4.1 堿性磷酸酶染色(ALP染色)鑒定貼壁細(xì)胞堿性磷酸酶特性 取經(jīng)分離培養(yǎng)傳代至第三代的貼壁細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,沿壁緩慢加入PBS清洗細(xì)胞2次,再加入ALP固定液固定3 min,PBS清洗2次, 加入ALP孵育液,避光孵育20 min,PBS清洗2次,加入核固紅染色液復(fù)染3 min,PBS清洗2次,顯微成像記錄結(jié)果。

    1.4.2 油紅O染色鑒定睪丸支持細(xì)胞內(nèi)脂滴分布 取經(jīng)分離培養(yǎng)傳代至第三代的貼壁細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗兩次,加ORO Fixative固定液固定20~30 min。棄固定液,用蒸餾水洗2次。加入60%異丙醇浸洗5 min,棄去60%異丙醇后加入新配制好的ORO Stain,浸染10~20 min。棄染色液,水洗2~5次,加入Mayer蘇木素染色液,復(fù)染核1~2 min。棄染液后水洗2~5次。加入ORO Buffer 1 min,棄去,加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在顯微鏡下觀察。

    1.4.3 GATA-4免疫熒光染色鑒定支持細(xì)胞標(biāo)志蛋白 取2.0×104個(gè)第3代細(xì)胞接種至12孔板,待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)棄培養(yǎng)基,PBS洗3次棄去,加入4%多聚甲醛室溫固定20 min,PBS洗3次, 加入PBS配制的0.5% Triton X-100處理20 min, PBS洗3次,3%BSA封閉30 min,加300 μL GATA-4 抗體(1∶150),4 ℃孵育過(guò)夜,PBS洗3次, 加入終濃度為5 μg·mL-1的DAPI染色5 min, PBS洗3次,顯微成像記錄結(jié)果。

    1.4.4 RT-PCR檢測(cè)鑒定支持細(xì)胞是否有間質(zhì)細(xì)胞、生精細(xì)胞污染 取經(jīng)分離培養(yǎng)傳至第三代的貼壁細(xì)胞,經(jīng)TRIzol法提取總RNA,TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, PCR擴(kuò)增SOX9、3β-羥類固醇脫氫酶7(3β-hydroxy-steroid-dehydrogenase 7,3β-HSD7)、DEAD盒解旋酶4(DEAD-box helicase 4,DDX4),擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系為20 μL, 引物加入終濃度為300 nmol·L-1,cDNA模板加入1 μL。Bio-Rad儀檢測(cè)程序: 95 ℃, 3 min,(95 ℃ 10 s, 60 ℃ 1 min) 循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,成像。

    1.5 睪丸支持細(xì)胞增殖曲線測(cè)定

    分別取第三代牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后,按每孔100 μL完全培養(yǎng)基接種7.5×103個(gè)細(xì)胞至96孔板中,分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行適宜培養(yǎng)基的比較,37 ℃,5% CO2培養(yǎng),接種培養(yǎng)后第2~6天,每間隔24 h進(jìn)行一次CCK8檢測(cè),每孔加入10 μL CCK8試劑,反應(yīng)1.5 h后檢測(cè)OD450 nm值,每天記錄支持細(xì)胞增殖活性變化數(shù)據(jù)。

    1.6 睪丸支持細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因表達(dá)檢測(cè)

    采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況,取第三代牦牛與犏牛支持細(xì)胞,采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,加入1 mL TRIzol室溫裂解支持細(xì)胞 5 min,加入200 μL氯仿,震蕩混勻,室溫放置2 min,4 ℃,12 000×g離心15 min,取上清置于新EP管中,記錄體積,加入等體積異丙醇,4 ℃,12 000×g離心10 min,棄上清液,加入1 mL 75% DEPC乙醇洗滌沉淀,4 ℃,7 500×g離心5 min,室溫放置干燥RNA沉淀,加入50 μL 無(wú) RNase水溶解RNA。取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,參考試劑說(shuō)明書(shū)操作,使用基因的特異上、下游檢測(cè)引物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè),包括GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA-4)、SOX9、WT1、干細(xì)胞因子(stem cell facor,SCF)、GDNF、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)、CXCL12、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,F(xiàn)GF2)、Ets差異基因5(Ets variant gene 5,ETV5)、白細(xì)胞介素1α(interleukin-1α,IL-1a)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、TGF-β1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、Fas細(xì)胞表面死亡受體(Fas cell surface death receptor,F(xiàn)as)、Fas基因配體(Fas ligand,F(xiàn)asL)、EGF,引物序列信息見(jiàn)表1。體系為20 μL,引物加入終濃度為400 nmol·L-1,cDNA模板加入1 μL。Bio-Rad CFX96 Real-time PCR儀檢測(cè)程序: 95 ℃,1 min, (95 ℃ 10 s, 58 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s)循環(huán)40次;循環(huán)結(jié)束后從65 ℃ 到95 ℃,每5 s上升0.5 ℃取熒光值繪制熔解曲線,確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

    表1 牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)qPCR檢測(cè)引物

    1.7 牦牛、犏牛睪丸支持細(xì)胞絲裂霉素C藥物耐受性檢測(cè)

    取兩種牛的第3代睪丸支持細(xì)胞接種至六孔板,待細(xì)胞長(zhǎng)至95%融合度,分別加入0.4、0.8、1.2 μL 絲裂霉素C(原液濃度為10 mmol·L-1),處理24 h后換液,分別培養(yǎng)1周、2周后記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

    1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    用GraphPad Prism對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。RT-qPCR定量結(jié)果采用△△Ct法進(jìn)行分析,每組試驗(yàn)重復(fù)3次以上,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,P<0.01 表示差異極顯著,P<0.05表示差異顯著。

    2 結(jié) 果

    2.1 牦牛與犏牛睪丸組織酶消化后支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)

    采用混合酶消化法獲得單個(gè)細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色與全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2,可見(jiàn)最初從牦牛睪丸組織分離出的細(xì)胞數(shù)目及活率均大于犏牛(圖1),為排除細(xì)胞碎片等雜質(zhì),計(jì)數(shù)粒徑范圍為9~30 μm。細(xì)胞混合液經(jīng)24 h差速貼壁,貼壁細(xì)胞有清晰的細(xì)胞輪廓,呈現(xiàn)多邊形或長(zhǎng)梭形,可見(jiàn)牦牛組織所得貼壁細(xì)胞的數(shù)目遠(yuǎn)多于犏牛組織,兩者細(xì)胞形態(tài)相似(圖2A、B)。移去上清液及上清中的生精細(xì)胞,饑餓處理24 h后,再次加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h(圖2C、D),再次移去上清及上清中殘留的生精細(xì)胞,加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,培養(yǎng)體系中僅剩余極少量懸浮的生精細(xì)胞,同時(shí)可以發(fā)現(xiàn),經(jīng)饑餓處理與反復(fù)差速貼壁后獲得的F1雄性犏牛貼壁細(xì)胞的數(shù)量及增殖速度低于牦牛(圖2E、F)。

    *.P<0.05; **. P<0.01; ***.P<0.001。下同

    A和B分別為牦牛和犏牛睪丸組織經(jīng)24 h培養(yǎng)后的混合細(xì)胞原液; C和D分別為經(jīng)24 h饑餓處理,再培養(yǎng)24 h的牦牛和犏?;旌霞?xì)胞組分; E和F分別為更換培養(yǎng)上清,再培養(yǎng)24 h的牦牛和犏?;旌霞?xì)胞組分

    表2 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率檢測(cè)

    2.2 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的鑒定

    將分離純化的貼壁細(xì)胞經(jīng)胰酶消化傳代,取第3代細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色、油紅O染色及GATA-4免疫熒光染色,結(jié)果如圖3所示,源自牦牛和犏牛的貼壁細(xì)胞油紅O染色均可見(jiàn)粉紅或橙色脂滴及支持細(xì)胞特有的雙極小體(圖3A、B),堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示,細(xì)胞質(zhì)未上色而細(xì)胞核均為紅色,所以堿性磷酸酶結(jié)果均為陰性(圖3C、D),同時(shí)取第3代貼壁細(xì)胞并通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn),支持細(xì)胞標(biāo)志蛋白GATA-4在兩牛種支持細(xì)胞均有明顯表達(dá),綠色為GATA-4特異性著色,藍(lán)色為細(xì)胞核,淺藍(lán)色為合并圖像(圖4A~F)。同時(shí)取第3代貼壁細(xì)胞進(jìn)行SOX9、3β-HSD7、DDX4基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物3β-HSD7、生殖細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物DDX4等在貼壁細(xì)胞中基本無(wú)表達(dá),SOX9作為睪丸支持細(xì)胞特異標(biāo)志物表達(dá)(圖5)。

    A和B分別為牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞油紅O染色,藍(lán)色為蘇木素染核,紅色箭頭為支持細(xì)胞特有雙極小體(400×);C和D分別為牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞堿性磷酸酶染色,紅色為甲基紅染核(100×)

    A、B、C為牦牛睪丸支持細(xì)胞,D、E、F為犏牛睪丸支持細(xì)胞,其中綠色為GATA-4特異性結(jié)合位點(diǎn),藍(lán)色為細(xì)胞核,淺藍(lán)色為合并圖像

    M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1、2. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞β-actin基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果;3、4. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞SOX9基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果;5、6. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞3β-HSD7基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果;7、8. 牦牛與犏牛分離純化貼壁細(xì)胞DDX4基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

    2.3 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的體外增殖

    為摸索更為適合的培養(yǎng)基,分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的培養(yǎng),利用CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞活性,繪制增殖曲線,如圖6所示,整體細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)S型,無(wú)論采用DMEM高糖培養(yǎng)基還是DMEM/F12培養(yǎng),牦牛睪丸支持細(xì)胞的增殖速率及活性遠(yuǎn)高于犏牛(圖6A、B);采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)兩牛種的睪丸支持細(xì)胞在細(xì)胞活性及增殖特性方面均優(yōu)于DMEM/F12培養(yǎng)基(圖6C、D)。

    A. 采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛與犏牛支持細(xì)胞的增殖曲線;B. 采用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛與犏牛支持細(xì)胞的增殖曲線;C. 分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛睪丸支持細(xì)胞的增殖曲線;D. 分別采用DMEM高糖與DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)犏牛睪丸支持細(xì)胞的增殖曲線

    2.4 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè)

    采用RT-qPCR方法檢測(cè)第三代睪丸支持細(xì)胞的特異標(biāo)志、免疫豁免和促精原干細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)GATA-4、SCF、BMP4、FGF2、ETV5、IL-1a、IL-6、TNF-α、Fas和FasL在兩牛種中的表達(dá)量無(wú)明顯差異;而GDNF、CXCL12、TGF-β1、SOX9和WT1基因在兩牛種中的表達(dá)存在明顯差異,與牦牛比較,GDNF在犏牛睪丸支持細(xì)胞中下調(diào)了3.4倍(P<0.05),CXCL12上調(diào)了3.6倍(P<0.05),TGF-β1下調(diào)了2.9倍(P<0.05),SOX9下調(diào)了25.9倍(P<0.01),WT1下調(diào)了38.7倍(P<0.01)(圖7)。

    圖7 牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

    2.5 絲裂霉素C處理牦牛與犏牛支持細(xì)胞

    加入不同濃度絲裂霉素C,分別處理牦牛與犏牛的睪丸支持細(xì)胞,比較牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞對(duì)絲裂霉素藥物的耐受性發(fā)現(xiàn),加入絲裂霉素C,牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞的形態(tài)均發(fā)生變化,胞質(zhì)有白色空泡,細(xì)胞核質(zhì)不明顯,但牦牛睪丸支持細(xì)胞整體存活數(shù)目、胞質(zhì)空泡情況優(yōu)于犏牛,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞存活狀態(tài)差異越大(圖8A~P)。加入0.8 μL 絲裂霉素C(原液濃度10 mmol·L-1)為較優(yōu)濃度,培養(yǎng)2周后細(xì)胞密度未增加,細(xì)胞未明顯死亡。

    從左到右,絲裂霉素C加入量分別為0、0.4、0.8、1.2 μL。A~D. 4種濃度絲裂霉素C處理牦牛睪丸支持細(xì)胞7 d后成像;E~H. 4種濃度絲裂霉素C處理犏牛睪丸支持細(xì)胞7 d后成像;I~L. 4種濃度絲裂霉素C處理牦牛睪丸支持細(xì)胞14 d后成像;M~P. 4種濃度絲裂霉素C處理犏牛睪丸支持細(xì)胞14 d后成像

    3 討 論

    睪丸支持細(xì)胞又稱Sertoli細(xì)胞,是最重要的生殖相關(guān)細(xì)胞,是唯一與生精細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞,其在維護(hù)睪丸生精環(huán)境、保證生精能力方面發(fā)揮著重要作用[14]。本試驗(yàn)通過(guò)混合酶消化、差速貼壁及饑餓處理分離純化牦牛與犏牛的睪丸支持細(xì)胞,睪丸組織經(jīng)混合酶消化后,得到睪丸細(xì)胞的混合組分,此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活率,發(fā)現(xiàn)使用等量的睪丸組織,牦牛睪丸組織消化所獲得的細(xì)胞量及細(xì)胞活率均高于犏牛?;旌霞?xì)胞經(jīng)差速貼壁及饑餓處理后,細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形或梭形,貼壁生長(zhǎng),與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的羊[15-16]、豬[17-18]、馬[19]等種屬來(lái)源的細(xì)胞形態(tài)一致。引用文獻(xiàn)[15-17, 19-20]中的油紅O染色、GATA-4特異標(biāo)志物的免疫熒光、堿性磷酸酶染色、RT-PCR對(duì)支持細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)ALP染色呈現(xiàn)陰性,排除管周細(xì)胞的污染[15],油紅O染色陽(yáng)性,GATA-4染色陽(yáng)性,通過(guò)RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果,發(fā)現(xiàn)幾乎未檢測(cè)到間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物3β-HSD[21-23]的表達(dá),可進(jìn)一步確認(rèn),所獲得的貼壁細(xì)胞大部分為睪丸支持細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示,使用DMEM高糖培養(yǎng)基更有利于牦?;蜿2G丸支持細(xì)胞的增殖,DMEM高糖培養(yǎng)基葡萄糖含量高,更適用于培養(yǎng)代謝旺盛的細(xì)胞,睪丸支持細(xì)胞增殖能力強(qiáng),按1∶3傳代約2 d即可達(dá)到95%以上融合度,因此,使用DMEM高糖培養(yǎng)基可能更有利于牦?;蜿2G丸支持細(xì)胞的增殖。

    本研究對(duì)比了牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下的增殖特性及基因表達(dá)的差異,CCK8檢測(cè)顯示,牦牛與犏牛支持細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)S型,細(xì)胞活性均在培養(yǎng)第5天到達(dá)最高,這與已報(bào)導(dǎo)的山羊[16]與和田羊[15]的增殖特性相似,同時(shí),無(wú)論采用DMEM高糖培養(yǎng)基還是DMEM/F12培養(yǎng)基,犏牛睪丸支持細(xì)胞體外增殖的能力及活性遠(yuǎn)低于牦牛。本研究對(duì)兩牛種睪丸支持細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究,包括睪丸支持細(xì)胞特異標(biāo)志物基因如GATA-4、SOX9、WT1;睪丸的局部免疫功能調(diào)節(jié)基因如IL-1a、IL-6、TNF-α、Fas、FasL;分泌蛋白因子調(diào)控生精過(guò)程相關(guān)基因如SCF、BMP4、FGF2、ETV5、GDNF、CXCL12、TGF-β1等[4, 14, 24-26]。發(fā)現(xiàn)GDNF、CXCL12、TGF-β1、SOX9和WT1基因在兩牛種中的表達(dá)存在明顯差異。其中,GDNF是維持精原干細(xì)胞自我更新和增殖的最重要因子,Aponte等[27]在進(jìn)行小牛精原干細(xì)胞的培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),相比其它生長(zhǎng)因子,在添加GDNF的培養(yǎng)體系中,A型精原細(xì)胞的數(shù)量增加最為顯著[11],在豬的精原干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中[28],也有同樣的結(jié)論。犏牛睪丸支持細(xì)胞低表達(dá)GDNF,可能造成精原干細(xì)胞的自我更新及增殖受阻,進(jìn)而出現(xiàn)文獻(xiàn)[29]中所述的F1代雄性犏牛睪丸組織中僅有少量精原細(xì)胞,無(wú)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞等現(xiàn)象。SOX9主要功能體現(xiàn)在調(diào)控睪丸支持細(xì)胞分化、調(diào)控睪丸發(fā)育、維持睪丸正常功能,可為發(fā)育中的精子提供保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)[30],SOX9在犏牛睪丸支持細(xì)胞低表達(dá),也是導(dǎo)致犏牛睪丸體積小、發(fā)育缺陷的可能原因之一。TGF-β除參與睪丸免疫豁免作用外[24, 26],還可作為細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子,調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的增殖[31]。本研究也發(fā)現(xiàn),TGF-β1在增殖能力更弱的犏牛睪丸支持細(xì)胞中低表達(dá)。這些重要基因轉(zhuǎn)錄水平的差異也進(jìn)一步提示了犏牛睪丸支持細(xì)胞基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平存在缺陷,這也可能是犏牛雄性不育的重要原因之一。

    飼養(yǎng)層細(xì)胞概念于1955年提出,可為目的細(xì)胞生存提供物理空間支持[32],分泌目的細(xì)胞所需生長(zhǎng)因子[33],睪丸支持細(xì)胞也是一種常見(jiàn)的飼養(yǎng)層細(xì)胞,廣泛應(yīng)用于精原干細(xì)胞的培養(yǎng)[26, 28, 34],睪丸支持細(xì)胞經(jīng)過(guò)絲裂霉素C處理后可作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。當(dāng)使用同種濃度絲裂霉素C分別處理牦牛與犏牛支持細(xì)胞時(shí),發(fā)現(xiàn)犏牛支持細(xì)胞對(duì)藥物處理更為敏感,相較于牦牛支持細(xì)胞,犏牛支持細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化明顯,貼壁細(xì)胞數(shù)目減少,胞質(zhì)空泡嚴(yán)重,也證明了犏牛睪丸支持細(xì)胞的耐受特性不及牦牛,推測(cè)牦牛睪丸支持細(xì)胞更加適合作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。精原干細(xì)胞是生精上皮中唯一可復(fù)制的多能二倍體細(xì)胞,它能將遺傳信息傳遞給后代,是精子發(fā)生的基礎(chǔ)[35],通過(guò)適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)環(huán)境誘導(dǎo)精原干細(xì)胞分化,可使其進(jìn)入減數(shù)分裂不同時(shí)期,相關(guān)的研究在豬[36]、山羊[37]、小鼠[35, 38]等物種中已開(kāi)展[39],這也是將來(lái)研究犏牛雄性不育的一個(gè)重要方向。

    4 結(jié) 論

    本研究建立了牦牛與犏牛睪丸支持細(xì)胞分離純化與體外培養(yǎng)方案,經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及標(biāo)志基因檢測(cè)鑒定,成功分離得到牦牛和犏牛睪丸支持細(xì)胞;兩牛種睪丸支持細(xì)胞雖然具有相似的形態(tài)特征,但犏牛支持細(xì)胞體外增殖能力較差,促睪丸生精細(xì)胞發(fā)育等關(guān)鍵基因表達(dá)豐度較低,對(duì)絲裂霉素C耐受特性差,提示犏牛睪丸支持細(xì)胞在上述方面的缺陷可能是導(dǎo)致犏牛雄性不育的原因之一。

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