一株抗多重耐藥菌海洋放線菌的篩選及其活性分析

陳美群 馮廣達(dá) 鄧名榮 朱紅惠

近年來，由于病原微生物耐藥性的日益增強(qiáng)和新型感染性疾病的不斷涌現(xiàn)，尋求和開發(fā)新的微生物資源，對新型抗生素的發(fā)現(xiàn)和耐藥性感染性疾病的治療具有重大的現(xiàn)實意義［1］。隨著陸源微生物資源的日趨枯竭，海洋將成為微生物資源的主要來源［2］。高鹽、高壓、低營養(yǎng)的獨特海洋環(huán)境，使海洋微生物形成了不同于陸源微生物的代謝途徑，產(chǎn)生大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、抑菌效果較好、或有特殊作用的生物活性物質(zhì)［3，4］。已知微生物來源的生物活性物質(zhì)中，放線菌來源的生物活性物質(zhì)約占70％，其中以鏈霉菌屬（Streptomyces）為主，約占50％［5］。海洋放線菌是新藥開發(fā)和天然活性產(chǎn)物的重要來源，有關(guān)海洋放線菌來源的新型生物活性物質(zhì)的報道正逐漸增多［6，7］，據(jù) Lam［8］不完全統(tǒng)計在 2003-2005年短短3年內(nèi)就從海洋放線菌中分離到23個具有較好開發(fā)潛力的新型藥源活性物質(zhì)，具有良好的抗菌、抗腫瘤等活性。本研究從分離自南海沉積物的71株放線菌中篩選到一株產(chǎn)高活性抗菌物質(zhì)的放線菌MQ-86，針對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，以闡明其分類地位。同時，對該菌株的最佳抑菌活性培養(yǎng)基以及其活性代謝產(chǎn)物對多株耐藥菌的抑制效果進(jìn)行初步的研究，旨在為下一步從該菌株中分離新型活性代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 71株放線菌菌株由廣東省微生物菌種保藏中心從南海沉積物樣品中分離并保藏。

1.1.2 受試菌株 3株普通菌：大腸桿菌（Escherichia coli）8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231由廣東省微生物菌種保藏中心提供；5株耐藥菌：大腸桿菌（Escherichia coli）480（耐11種抗生素）、大腸桿菌（Escherichia coli）460（耐11種抗生素）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206（耐13種抗生素）、沙門氏菌（Salmonella sp.）47（耐9種抗生素）、沙門氏菌（Salmonella sp.）31（耐9種抗生素）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔣紅霞教授惠贈。

1.1.3 培養(yǎng)基［9，10］①高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，蒸餾水1000mL，pH7.2；②氯化鈣（CL）培養(yǎng)基：CaCl245g，酵母提取物40g，葡萄糖5g，蒸餾水1000mL，pH7.8；③GBP培養(yǎng)基：葡萄糖10g，牛肉膏3g，蛋白胨5g，蒸餾水1000mL，pH7.2；④培養(yǎng)基：大麥提取物（Malt extract）10g，葡萄糖4g，酵母提取物4g，蒸餾水1000mL，pH7.8；⑤營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH7.2-7.6；⑥PGY培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖1g，蒸餾水1000mL，pH6.8-7.0。

1.2 方法

1.2.1 抗菌活性菌株的初篩 將71株海洋放線菌接種于100mL高氏一號培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)7d，發(fā)酵液在8000r/min條件下離心20min，上清液用8層紗布過濾，濾液用等體積乙酸乙酯萃取后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得代謝產(chǎn)物粗提物，用甲醇將代謝產(chǎn)物溶解定容至1mL，得代謝產(chǎn)物粗提液。抑菌活性的篩選采用瓊脂平板打孔法［11］，以大腸桿菌（Escherichia coli）8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231為指示菌。在每個培養(yǎng)皿內(nèi)打孔4個，其中3個孔注入發(fā)酵代謝產(chǎn)物粗提液30μL，另一個孔注入液體培養(yǎng)基30μL作為空白對照，每個處理重復(fù)3次，待培養(yǎng)后觀察記錄抑菌圈結(jié)果。

1.2.2 菌株MQ-86最佳抑菌活性培養(yǎng)基的篩選 將放線菌MQ-86接種于高氏一號培養(yǎng)基、GBP培養(yǎng)基、氯化鈣（CL）培養(yǎng)基和培養(yǎng)基中，參考“1.2.1方法”進(jìn)行最佳抑菌活性培養(yǎng)基的篩選。

1.2.3 菌株MQ-86的抑菌活性研究 將菌株MQ-86接種到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基（培養(yǎng)基）中，按“1.2.1方法”得到代謝產(chǎn)物的粗提物，進(jìn)行其抑菌活性的分析。以3株普通菌：大腸桿菌（Escherichia coli）8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231和5株耐藥菌：大腸桿菌（Escherichia coli）480、大腸桿菌（Escherichia coli）460、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206、沙門氏菌（Salmonella sp.）47、沙門氏菌（Salmonella sp.）31為受試菌。將受試菌原液用梯度稀釋法稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)，制得不同濃度的受試菌菌懸液。在營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上加100μL不同濃度的受試細(xì)菌菌懸液，涂布均勻，在PGY瓊脂平板上加100μL不同濃度的白色念珠菌（Candida albicans）10231菌懸液，涂布均勻。待干后用打孔器（直徑5mm）在每個培養(yǎng)皿內(nèi)打孔4個，其中2個孔注入MQ-86菌株的代謝產(chǎn)物粗提液30μL，一個孔以氨芐青霉素100μg/mL作陽性對照，另一個孔以甲醇做陰性對照，每個處理重復(fù)3次。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24h，白色念珠菌于28℃培養(yǎng)48h，觀察記錄抑菌結(jié)果并測量其抑菌圈直徑。

1.2.4 菌種鑒定 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定：參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［12］和《鏈霉菌鑒定手冊》［13］。

分子生物學(xué)鑒定：對獲得的純培養(yǎng)物菌株使用BIOMIGA基因組抽提試劑盒提取總DNA，然后用于目的基因的擴(kuò)增。放線菌16S rDNA部分序列的擴(kuò)增采用通用引物27F/1492R［14］。擴(kuò)增程序如下：94℃5min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，30 個 循環(huán)；72℃ 10min。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測、純化后，送交測序公司測序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對分析，獲取相近典型菌株的16S rDNA序列，然后用CLUSTAL X軟件進(jìn)行全序列比對，利用MEGA3.0中的鄰接法（Neighbor-Joining）［15］建立16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 抗菌活性海洋放線菌的初篩

在71株海洋放線菌的高氏一號發(fā)酵粗提物中沒有1株放線菌對大腸桿菌有抑制作用；有4株對白色念珠菌有抑制作用，占總菌數(shù)的5.63％；有20株對金黃色葡萄球菌有抑制作用，占總菌數(shù)的28.17％（表1），其中菌株MQ-86對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于20mm，抗菌效果最好。

表1 71株海洋放線菌的抑菌活性初篩

2.2 海洋放線菌MQ-86 最佳抑菌活性培養(yǎng)基的篩選

不同培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的抑菌活性如表2所示。M2+培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物具有較強(qiáng)的抑菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌都有很好的抑菌活性，尤其對白色念珠菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到了29.33mm。而CL培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物卻完全失去了抑菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌都沒有抑菌活性。高氏一號、GBP培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物都能對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌活性，而對大腸桿菌、白色念珠菌都沒有任何抑制效果，其原因可能是不同的發(fā)酵培養(yǎng)基組分改變了菌株MQ-86的代謝產(chǎn)物種類或產(chǎn)量。由此可見，海洋放線菌MQ-86的最佳抑菌活性培養(yǎng)基為培養(yǎng)基。

表2 菌株MQ-86不同培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物的抑菌活性

2.3 菌株MQ-86 最佳發(fā)酵培養(yǎng)基粗提物抑菌活性分析結(jié)果

2.4 菌株MQ-86鑒定結(jié)果

菌株MQ-86在高氏一號培養(yǎng)基生長旺盛，28℃培養(yǎng)7d菌落直徑達(dá)3.0-4.0mm；菌落呈圓形、表面凹凸不平、邊緣白色、中間淺灰色、可溶色素呈粉紅色；基內(nèi)菌絲和氣生菌絲均很豐富，基內(nèi)菌絲無橫隔、不斷裂；氣生菌絲柔曲、多分枝；孢子絲直形、中長（圖2）。該菌株能夠分解纖維素，水解淀粉，還原硝酸鹽，明膠液化緩慢，牛奶不凝固，不產(chǎn)生黑色素、酪氨酸酶和硫化氫，能利用阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和鼠李糖，不能利用棉籽糖、甘露醇和肌醇。對菌株MQ-86的16S rDNA擴(kuò)增測序，從GenBank中得到相關(guān)菌株的16S rDNA序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明，該菌株與小鏈霉菌NR043833.1處于同一分支、序列同源性高達(dá)99.89％。結(jié)合其形態(tài)學(xué)和生理生化特征，初步鑒定為小鏈霉菌（Streptomyces parvus）MQ-86。

表3 菌株MQ-86的培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物對供試菌株的抑制效果

表3 菌株MQ-86的培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物對供試菌株的抑制效果

-：表示無抑菌活性

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圖 1 菌株MQ-86的+培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物對部分受試菌的抑制效果

圖2 菌株MQ-86的形態(tài)特征

3 討論

目前，抗生素類藥物在臨床上得到廣泛的使用，使由微生物引起的感染性疾病得到有效的控制，但同時也導(dǎo)致許多致病菌對抗生素類藥物產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，特別是耐藥性的腸桿菌和葡萄球菌的蔓延，極大地危害著人類的健康［16］。萬古霉素被公認(rèn)為是目前最有效的抗生素，但耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌也已出現(xiàn)［17］。2010年在南亞發(fā)現(xiàn)的新型超級病菌NDM-1［18］，它對除替加環(huán)素和黏菌素以外的所有已知抗生素都具有耐藥性。耐藥菌株的逐漸增多及其耐藥性的不斷增強(qiáng)限制了現(xiàn)有抗生素的臨床治療效果，尋找和開發(fā)新型抗生素資源勢在必行。放線菌代謝具有多樣性，能夠產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)極其豐富，是新型抗生素的主要來源。海洋放線菌研究起步較晚，目前從海洋分離到的放線菌有18個屬，約占放線菌總屬數(shù)的10％，可見未知的海洋放線菌資源數(shù)量巨大，從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)新型抗菌活性物質(zhì)的機(jī)率較高［19］。

圖3 菌株MQ-86的16S rDNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

本研究從71株海洋放線菌中篩選到一株產(chǎn)高活性抗菌物質(zhì)的放線菌MQ-86，對其進(jìn)行了初步鑒定和抗耐藥菌活性的研究。初步鑒定MQ-86為小鏈霉菌，鏈霉菌是產(chǎn)抗菌素類物質(zhì)的重要資源菌種，國內(nèi)外研究表明鏈霉菌產(chǎn)生的抗菌素類物質(zhì)具有較好的抑菌效果和無毒副作用等優(yōu)點［20，21］，具有重要的商業(yè)和醫(yī)用價值，但目前對小鏈霉菌（Streptomyces parvus）的研究資料仍相對匱乏。除孫建龍等［22］從大連海域分離的小鏈霉菌PH33對番茄潰瘍病菌具有較強(qiáng)的抑制活性、康銀花等［23］報道的小鏈霉菌NIM521能對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）有強(qiáng)烈抑制活性和田兆豐等［24］分離的小鏈霉菌Yn168能夠拮抗3種植物病毒外，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)小鏈霉菌抑制病害菌及耐藥菌的報道。本研究分離的菌株（Streptomycete parvus）MQ-86的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對共耐18種常用抗生素的耐藥性大腸桿菌480/460（耐環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素）和耐藥性金黃色葡萄球菌206（耐環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、四環(huán)素、氯霉素、頭孢曲松、青霉素、苯唑西林、紅霉素、替卡西林、磺胺甲惡唑、阿米卡星）都有明顯的抑制作用，表明菌株MQ-86具有可觀的研究前景和藥用潛力。目前我們正在對該菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行其結(jié)構(gòu)的鑒定和活性測試，以期為新型藥物的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用平板打孔抑菌法篩選對多重耐藥菌的抑制作用；通過菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列對菌株進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果顯示，篩選到一株對多株多重耐藥菌均有較強(qiáng)抑制作用的海洋放線菌MQ-86，菌株MQ-86的M2+培養(yǎng)基粗提物對普通的大腸桿菌（Escherichia coli）8739、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）6538、白色念珠菌（Candida albicans）10231和共耐18種主要抗生素的多重耐藥性大腸桿菌（Escherichia coli）480、大腸桿菌（Escherichia coli）460、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）206都有較好的抑制效果。菌株MQ-86對多株多重耐藥菌均具有較強(qiáng)的抑制活性，經(jīng)初步鑒定為小鏈霉菌（Streptomyces parvus）。

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