鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因全長(zhǎng)的克隆與抗原決定簇分析

郭松林 王玉 關(guān)瑞章 馮建軍 林鵬 楊求華

鰻鱺疾病按病原可分為細(xì)菌性、真菌性、寄生蟲(chóng)性、病毒性及其他類型病原五大類，其中細(xì)菌性疾病危害十分嚴(yán)重，其導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失占疾病總損失的90％以上。已發(fā)現(xiàn)的歐洲鰻鱺細(xì)菌性病原有十幾種，包括氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、威隆氣單胞菌（也稱維氏氣單胞菌，A.veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）和獸生氣單胞菌（A.bestiarum），愛(ài)德華氏菌屬的遲頓愛(ài)德華氏菌以及弧菌屬的致傷弧菌、鰻弧菌和非01群霍亂弧菌［1-4］。在我們課題組近10年建立的87株鰻鱺病原菌菌種庫(kù)中，有約80％為病原性氣單胞菌。由于氣單胞菌血清型復(fù)雜［5］，且具有地緣性與種間特異性［6］，故研制的滅活疫苗難以在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用［7］。解決此問(wèn)題的途經(jīng)之一是尋找病原菌間的共同保護(hù)性抗原基因片段，以制備預(yù)防同種或同屬但血清型不同病原菌所致疾病的基因工程疫苗［8］。革蘭氏陰性病原菌表面的外膜蛋白（Outermembrane proteins，OMP）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有成分，除了在維持菌體外膜結(jié)構(gòu)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮重要作用外，還是一種重要的保護(hù)性抗原，能有效激發(fā)宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫，在宿主體內(nèi)具有良好的免疫原性［9］。同時(shí)，某些OMP在多種病原菌間存在高度保守性，可對(duì)同屬不同種或同種不同血清型菌株的感染產(chǎn)生交叉保護(hù)，從而成為亞單位疫苗最具潛力的抗原候選成分之一［10-12］。

本研究擬采用已分離到的30株鰻鱺病原性氣單胞菌為材料，使用NCBI/GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得多個(gè)氣單胞菌的外膜蛋白基因序列，經(jīng)比對(duì)分析后，從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞胞菌（A.salmonicida）全基因組中釣出特定外膜蛋白的基因全長(zhǎng)及該基因以外兩端的序列，據(jù)這兩端序列在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞胞菌中的保守性設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增30株病原性氣單胞菌的外膜蛋白基因并對(duì)其推導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，從而為鰻鱺外膜蛋白共同保護(hù)性抗原基因工程疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)儀器主要包括高速冷凍離心機(jī)（Sigma），臺(tái)式離心機(jī)H1650-W（湖南湘儀），PCR儀（東勝創(chuàng)新），瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一），生化培養(yǎng)箱（SHP-250）和微波爐（DJ21F-B）等。主要試劑為 Taq 酶（5U/μL），dNTP（2.5mmol/L），10×loading buffer，引物和DNA Marker購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，溴化乙錠（EB）購(gòu)自百維信公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自BioTeke公司。

30株鰻鱺病原性氣單胞菌由鰻鱺工程研究中心病原菌菌種庫(kù)提供，經(jīng)Biolog自動(dòng)菌鑒系統(tǒng)（含96個(gè)生化指標(biāo)）分別鑒定到種或?qū)佟Ｆ渲惺人畾鈫伟?株；威隆氣單胞菌16株；豚鼠氣單胞菌3株；簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌1株；另1株僅鑒定為氣單胞菌屬（表 1）。

表1 30株病原性氣單胞菌的鑒定結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與DNA模板的制備 30株病原菌接種于胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基（TSB），28℃培養(yǎng)24h。采用BioTeke公司的試劑盒（離心柱型）提取，提取方法參考試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書。提取的DNA經(jīng)1 ％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA含量，調(diào)DNA含量為50ng/μL，備用。

1.2.2 病原性氣單胞菌外膜蛋白基因序列的檢索、篩選與比對(duì) 利用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI/GenBank，以關(guān)鍵詞 “outerme-mbrane protein” ＆“Aeromonas”進(jìn)行檢索。下載包括基因登錄號(hào)，基因序列，病原菌來(lái)源等外膜蛋白序列的主要信息，建立氣單胞菌外膜蛋白（Aeromonas ＆ outermembrane protein）基因資料庫(kù)。選取資料庫(kù)中17株700bp以上的外膜蛋白基因序列（GenBank序列登錄號(hào)：HQ331525.1，HM-114316.1，GU134620.1，AF146597.2，F(xiàn)J437031.1，F(xiàn)J-437030.1，GU196148.1，DQ008470.1，AY442271.1，AY378290.1，AF276639.2，F(xiàn)J208990.1，EU309491.1，DQ177328.1，AB290200.1，F(xiàn)J711769.1，AF183931.1），經(jīng)Clustal X1.83比對(duì)分析后，采用Mega4.0軟件構(gòu)建17條序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 參考17條序列的基因比對(duì)結(jié)果，采用其中4條外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因序列（AF183931.1，AF276639.2，F(xiàn)J437031.1，F(xiàn)J437030.1）的高度保守區(qū)域（ccgaccgatatcttcaacgagtg），從嗜水氣單胞菌（登錄號(hào)：CP000462）和殺鮭氣單胞菌（登錄號(hào)：CP000644）基因組全長(zhǎng)序列中釣出該蛋白的基因全長(zhǎng)及該基因外上游與下游的兩端序列。根據(jù)兩端序列在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的保守性，采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)增30株病原性氣單胞菌的Ⅱ型孔蛋白（約1250bp）。上游引物F：5' CTTCGCTGACACAGGGAATAAC 3'，下游引物 R：5' AGACAACGTGAACTGGCG 3'。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50μL）：10×PCR Buffer 5μL，dNTP（10mmol/L）0.5μL，引物（10μmol/L）各 0.2μL，Taq 酶（5U/μL）0.4μL，DNA 模 板 2μL， 補(bǔ)無(wú)菌水至50μL。反應(yīng)條件：94℃變性5min，94℃1min，51℃ 1min，72℃ 2min，33 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 l0min，4℃ 保存。

1.2.4 擴(kuò)增基因的測(cè)序與比對(duì)分析 PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％ 瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照記錄擴(kuò)增效果。將擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收后送至Invitrogen公司直接測(cè)序，然后用ClustalX1.83比對(duì)分析后，采用Mega4.0軟件構(gòu)建測(cè)序結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 氨基酸序列的比對(duì)分析 將擴(kuò)增到的10株氣單胞菌基因和網(wǎng)上已經(jīng)遞交的2個(gè)Ⅱ型孔蛋白全長(zhǎng)序列翻譯為氨基酸序列后，用ClustalX1.83進(jìn)行多重比對(duì)并列表分析Ⅱ型孔蛋白氨基酸序列的相似性。1.2.6 推導(dǎo)Ⅱ型孔蛋白的結(jié)構(gòu)、親水性與抗原決空簇分析 據(jù)擴(kuò)增得到的10株氣單胞菌的外膜蛋白全長(zhǎng)序列，選取其中一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白DNA全長(zhǎng)序列，轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后，用SOPMA程序（http：//www.expasy.ch/tools/）和 SOSUI 法［14］（http：//bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html）分別對(duì)推導(dǎo)蛋白進(jìn)行二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；以DNAstar軟件的Editseq和Protean程序分別對(duì)該蛋白質(zhì)分別進(jìn)行親水性與免疫原性分析［13］，通過(guò)BioEdit和Clustalx軟件分別對(duì)10個(gè)氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白DNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行抗原決定簇及其保守性比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 氣單胞菌外膜蛋白參考序列的系統(tǒng)發(fā)育

從17條氣單胞菌外膜蛋白基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可知，在黑箭頭處遺傳距離標(biāo)尺約0.13時(shí)，這些序列可分為8個(gè)分支，第一個(gè)分支有6條序列，其中2條為主要外膜蛋白（DQ008470.1，F(xiàn)J20899-0.1），3條為推測(cè)外膜蛋白（AY442271.1，AF1465-97.2，EU309491.1），1條為外膜蛋白A前體（GU-196148.1）；第2個(gè)分支為2條I型外膜蛋白序列（AB290200.1、FJ711769.1）；第 3個(gè)分支為 4條Ⅱ型孔蛋白序列（AF183931.1，AF276639.2，F(xiàn)J4370-31.1，F(xiàn)J437030.1）。其余5條序列各為1個(gè)分支，分別為主要外膜蛋白（DQ008470.1），外膜蛋白前體N（AY378290.1），外膜蛋白（GU134620.1），外膜蛋白W（HM114316.1）和類似外膜蛋白（HQ331525.1）（圖1）。由于前3個(gè)分支只有4個(gè)Ⅱ型孔蛋白序列有一個(gè)高度保守的片段（ccgaccgatatcttcaacgagtg），故使用這個(gè)外膜蛋白進(jìn)行鰻鱺病原性氣單胞菌的外膜蛋白擴(kuò)增。

圖1 17個(gè)氣單胞菌已知外膜蛋白基因片段的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增

通過(guò)PCR擴(kuò)增30株病原性氣單胞菌的Ⅱ型孔蛋白基因，經(jīng)瓊脂糖電泳結(jié)果（圖2）顯示，有11株 菌（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B60-1、B65）都得到了較單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增出的基因分子量在1200bp左右，與預(yù)期目的條帶大小一致，除一株菌（B60-1）外，其余10株菌均測(cè)出Ⅱ型孔蛋白的全長(zhǎng)序列。

圖2 30株氣單胞菌外膜蛋白基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 鰻鱺病原性氣單胞菌外膜蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

10 個(gè)（B11、B14、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因全長(zhǎng)序列的開(kāi)放閱讀框在1038bp到1 125bp之間。這10個(gè)菌株包括2株威隆氣單胞菌（B53、B53-1）和1株豚鼠氣單胞菌（B14），其余7株為嗜水氣單胞菌（表1）。將10條序列與1條已知Ⅱ型孔蛋白（AF-183931.1）和2條分別從嗜水氣單胞菌（登錄號(hào)：CP000462）和殺鮭氣單胞菌（登錄號(hào)：CP000644）基因組全長(zhǎng)釣出的Ⅱ型孔蛋白序列（seqAh-omp II和seqAs-omp II）進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖3）表明，除1株豚鼠氣單胞菌（B14）外，其余12個(gè)Ⅱ型孔蛋白基因均具有較高的同源性。Mega4.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，該基因在菌株間的遺傳距離在0.000-0.358之間，平均為0.179，其中菌株B11與其余菌株在該序列的平均遺傳距離為0.187，接近平均遺傳距離。因此，本研究以該序列的理論表達(dá)產(chǎn)物為代表進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與抗原決定簇分析，從而為該基因的進(jìn)一步表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性及交叉保護(hù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

圖3 13個(gè)病原性氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白基因全長(zhǎng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 B11菌株Ⅱ型孔蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能

2.4.1 二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 采用SOPMA 程序?qū)11菌株OMPⅡ的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析。結(jié)果表明，該基因共編碼 362個(gè)氨基酸，其中有78個(gè)堿性氨基酸（28個(gè)賴氨酸K，9個(gè)精氨酸R，41個(gè)組氨酸H）和52個(gè)酸性氨基酸（36個(gè)天冬氨酸D，16個(gè)谷氨酸E）；132個(gè)非極性疏水氨基酸（39個(gè)丙氨酸A，14個(gè)異亮氨酸I，24個(gè)亮氨酸L，23個(gè)苯丙氨酸F，7個(gè)色氨酸W，25個(gè)纈氨酸V）和163個(gè)極性中性氨基酸（23個(gè)天冬酰胺N，1個(gè)半胱氨酸C，14個(gè)谷氨酰胺Q，26個(gè)絲氨酸，27個(gè)蘇氨酸T，26個(gè)酪氨酸Y，42個(gè)甘氨酸G，4個(gè)蛋氨酸M）；3個(gè)脯氨酸P，1個(gè)任意氨基酸X。利用SOPMA 程序預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4）顯示，此外膜蛋白可形成螺旋（Helix）、片層（Sheet）、轉(zhuǎn)角（Turn）和卷曲（Coil）等結(jié)構(gòu)；其中α螺旋（Alphahelix Ah）比例約27.81％；未形成β螺旋和γ螺旋；舒展性螺旋（Extended strand Ee）比例約25.00％；β轉(zhuǎn)角（Beta turn Tt）比例約3.57％；無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil Cc）比例約43.62％；其他結(jié)構(gòu)域?yàn)? 。

圖4 SOPMA法預(yù)測(cè)Ⅱ型孔蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

SOSUI 法預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，外膜蛋白氨基酸序列存在信號(hào)肽區(qū)和跨膜螺旋區(qū)，其中前者由4個(gè)氨基酸組成，后者由23個(gè)氨基酸組成，其余335個(gè)氨基酸均為該外膜蛋白細(xì)胞膜外的氨基酸序列，這些膜外序列常認(rèn)為是可刺激宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的保護(hù)性抗原。

圖5 SOSUI 法預(yù)測(cè)Ⅱ型孔蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4.2 親水性分析 DNAstar軟件Protean TM程序的Plot-Kyte-Doolittle 法預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，此外膜蛋白有大約90％以上的區(qū)域處于正高分值（縱坐標(biāo)正值越大，親水性越強(qiáng)），表明該蛋白具有良好的親水性，屬親水性蛋白，此結(jié)果為該基因所表達(dá)蛋白質(zhì)的純化提供了有價(jià)值的參考。

圖6 Ⅱ型孔蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的的親水性分析

2.4.3 抗原決定簇分析 采用DNASTAR軟件Lasergene程序ProteanTM模塊中的Jomeson-Wolf 法預(yù)測(cè)分析Ⅱ型孔蛋白的免疫原性，結(jié)果（圖7）表明此外膜蛋白大約85％抗原峰值大于臨界值0，處于正分處（縱坐標(biāo)正值越大，免疫原性越強(qiáng)）。根據(jù)主要的抗原峰推測(cè)該蛋白有15個(gè)抗原決定簇，其在蛋白質(zhì)上的氨基酸順序分別位于24-32、43-53、84-92、94-101、103-112、120-127、157-163、181-187、194-201、237-248、266-274、275-285、307-312、314-322和346-355，指示該蛋白理論上具有良好的免疫原性。

圖7 Ⅱ型孔蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性分析

2.5 Ⅱ型孔蛋白基因推導(dǎo)氨基酸序列的比對(duì)與共同抗原決定簇分析

通 過(guò) BioEdit和 Clustal X軟 件 對(duì) 9個(gè)（B11、B20、B48、B50、B53、B53-1、B56-1、B60、B65）Ⅱ型孔蛋白基因和3個(gè)參考基因（AF183931.1，seqAh-omp II和seqAs-omp II）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)孔蛋白的氨基酸序列具有較高的同源性。將這些同源序列與B11菌株的抗原決定簇分析結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)存在于12株菌中的保守抗原決定簇（圖8，下劃線部分）。這6個(gè)抗原決定簇在B11中的氨基酸序列分別為第24-32（YDKDGTTFD），120-127（DGSQYGKI），157-163：（DGRQEGQ），181-187（TNDDQAV），275-285（GYKDKGRGYEL）和 346-355（MDNKDDEWTV）。6個(gè)保守抗原決定簇仍然存在少許的差異：第一個(gè)決定簇的第7個(gè)氨基酸在B53和B53-1中為S，而在其它菌株中為T；第2個(gè)決定簇的第2個(gè)氨基酸在seqAs-ompII和B11中為S，而在其它菌株中為T，第7個(gè)氨基酸在AF183931.1中為V，其他菌株中為I；第3個(gè)決定簇的第2個(gè)氨基酸在seqAs-ompII中為S，其它菌株中為G；第4個(gè)決定簇的第4個(gè)氨基酸在B48和B65中為N，其它菌株中為D，但在第5個(gè)氨基酸處區(qū)別稍大，4個(gè)K，3個(gè)Q，E和V各兩個(gè)，1個(gè)T，第7個(gè)氨基酸在seqAs-ompII中為E，其它菌株中為V；第5個(gè)決定簇的第2個(gè)氨基酸區(qū)別稍大，有5個(gè)Y，4個(gè)D，2個(gè)N和1個(gè)R，第4個(gè)氨基酸在B48和B65中為G，其它菌株中為D；第6個(gè)決定簇的第3個(gè)氨基酸在seqAs-ompII、AF183931.1和B20中為D，其它菌株中為E；第4個(gè)氨基酸在B20、AF183931.1、B53和B53-1中為F，而在其他菌株中為W。

3 討論

近年的大量研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類病原菌的外膜蛋白（OMP）是疫苗研制的重要保護(hù)性抗原［12，13］。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，越來(lái)越多的病原菌OMP基因測(cè)序得以完成。根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)已知OMP的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，然后從魚(yú)類病原菌庫(kù)的基因組中擴(kuò)增目標(biāo)基因，再利用合適的載體進(jìn)行重組表達(dá)，大大加快了疫苗抗原篩選的速度。這些重組OMP保持了天然OMP的免疫原性和免疫保護(hù)作用，均能有效刺激魚(yú)體產(chǎn)生特異性抗體［8］，某些OMP還能顯著增強(qiáng)機(jī)體吞噬細(xì)胞的吞噬活性［15］，并能對(duì)相應(yīng)病原菌的攻毒感染提供50％-100％不等的免疫保護(hù)率。隨著研究的深入，目前已發(fā)現(xiàn)某些OMP為不同病原菌或同種病原菌不同血清型的共同保護(hù)性抗原，免疫后可對(duì)多種病原菌的交叉感染提供免疫保護(hù)作用。Kawai等［16］分別從3株不同血清型的遲鈍愛(ài)德華氏菌中，利用十二烷基肌氨酸鈉抽提、超速離心、免疫印跡、雙向電泳等方法均分離純化到分子量大小約為37kD的OMP。該蛋白免疫日本牙鲆后，對(duì)3株病原菌的感染分別提供50％、65.5％和70％的交叉免疫保護(hù)作用。Fang等獲得分子量為43kD 的重組OMP，并利用氨基酸序列同源性分析、Western blot 免疫印跡等方法證明該OMP是9株嗜水氣單胞菌和1株溫和氣單胞菌的共同OMP抗原。該重組OMP免疫藍(lán)絲鱸后，能夠針對(duì)其中2株相同血清型和1株不同血清型嗜水氣單胞菌的感染提供分別為87.5％、75％和44.4 ％的交叉免疫保護(hù)率［17］。同時(shí)，也可利用融合PCR 技術(shù)將多種共同或主要抗原基因進(jìn)行融合表達(dá)，以進(jìn)一步構(gòu)建多價(jià)重組外膜蛋白疫苗，從而進(jìn)一步擴(kuò)大對(duì)病原菌的交叉保護(hù)范圍［18］。

圖8 12個(gè)Ⅱ型孔蛋白基因推導(dǎo)的氨基酸序列的比對(duì)

本研究利用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI/GenBank，找到氣單胞菌屬的17外膜蛋白基因序列并進(jìn)行比對(duì)，采用相關(guān)軟件構(gòu)建這些序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；并通過(guò)一定的遺傳距離將其分為8個(gè)分支，若分支中含有多個(gè)序列，則根據(jù)其保守區(qū)域從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)分別為CP000462和CP000644）中搜索該基因在基因組中的位置并在該基因之外的上下游約100bp的兩端設(shè)計(jì)引物，以擴(kuò)增出該基因序列的全長(zhǎng)。本試驗(yàn)根據(jù)圖1的第1、2和4等3個(gè)分支分別找到了3個(gè)基因在嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組全長(zhǎng)序列中的位置，并按上述方法分別設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，以30株病原性氣單胞菌的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)第4個(gè)分支的II型孔蛋白基因能擴(kuò)增到11個(gè)目的基因并測(cè)出了其中10個(gè)基因的全長(zhǎng)序列，其余兩支僅分別能擴(kuò)增到4株和0株菌的基因（數(shù)據(jù)未在本論文提供），表明II型孔蛋白可能是存在于鰻鱺源病原性氣單胞菌的主要外膜蛋白［5］。

擴(kuò)增10株菌的OMP基因序列與3個(gè)參考序列比對(duì)分析后顯示，B11菌株的OMP基因序列與其它菌株的序列平均遺傳距離居中，有可能成為這些菌株間的交叉保護(hù)抗原。此外，B11菌株毒性較強(qiáng)，其對(duì)歐洲鰻鱺的半數(shù)致死量約為105CFU/g體重［19］，且具有良好的研究背景［5，20-21］。采用該基因約500bp的序列片段構(gòu)建重組表達(dá)載體，其表達(dá)的30kD外膜蛋白經(jīng)皮下注射免疫歐洲鰻鱺后，對(duì)嗜水氣單胞菌（B11）和溫和氣單胞菌的攻素毒感染能分別提供50％和70％的相對(duì)保護(hù)率［12］。免疫原性分析表明，該表達(dá)產(chǎn)物有15個(gè)抗原決定簇，其中14個(gè)決定簇位于該蛋白的細(xì)胞膜外區(qū)域，有望在病原性氣單胞菌間產(chǎn)生廣泛的交叉免疫保護(hù)作用［18，22］。因此，本研究采用的免疫原性分析軟件對(duì)II型孔蛋白基表達(dá)產(chǎn)物的理論分析具有較好的預(yù)測(cè)能力。另外，對(duì)12個(gè)基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析后，發(fā)現(xiàn)存在于多株鰻鱺病原性氣單胞菌間的6個(gè)較為保守的抗原決定簇，提示該基因表達(dá)的OMP很可能對(duì)多株病原菌的感染產(chǎn)生交叉保護(hù)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

B11菌株擴(kuò)增基因推導(dǎo)OMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白有362個(gè)氨基酸，能形成的螺旋（Helix）、片層（Sheet）、轉(zhuǎn)角（Turn）和卷曲（Coil）等結(jié)構(gòu)，提示其具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)；三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白具有信號(hào)肽、跨膜區(qū)和膜外區(qū)域，而膜外蛋白區(qū)域通常直接暴露于魚(yú)類的免疫系統(tǒng)，易被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)［8，12］。因此，二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析為該蛋白的免疫原性研究奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)［23］。此外，該OMP的親水性分析表明其親水性較高，此結(jié)果為該表達(dá)蛋白的進(jìn)一步純化提供了有價(jià)值的參考［24］。值得一提的是，本研究材料中的30個(gè)菌株包含4種細(xì)菌，從1株豚鼠氣單胞菌（B14）擴(kuò)增到的該基因與其他9個(gè)基因同源性很低，未從簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌（B29）中擴(kuò)增到該外膜蛋白基因，因此，B11菌株表達(dá)的OMP對(duì)這兩個(gè)菌種的免疫交叉保護(hù)也有待于研究證實(shí)。然而，我們的研究表明，嗜水氣單胞菌和威隆氣單胞菌為近10年從養(yǎng)殖的發(fā)病鰻鱺分離的主要菌株［21，25］，以本研究為基礎(chǔ)研制的外膜蛋白共同保護(hù)性疫苗將具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

比對(duì)17個(gè)氣單胞菌己知外膜蛋白基因序列，獲得其中一種外膜蛋白（Ⅱ型孔蛋白）基因的保守片段，通過(guò)該片段從嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌基因組中釣出該基因全長(zhǎng)。據(jù)該基因以外兩端的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以30株鰻鱺病原性氣單胞菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增并獲得10株菌的Ⅱ型孔蛋白基因全長(zhǎng)。經(jīng)遺傳距離分析后選擇一株菌（B11）的Ⅱ型孔蛋白基因，該基因的表達(dá)產(chǎn)物具有三級(jí)結(jié)構(gòu)，親水性強(qiáng)且有15個(gè)抗原決定簇，其中6個(gè)為存在于9株鰻鱺病原菌間的保守抗原決定簇。

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