一株氨基半乳糖產(chǎn)生菌的篩選鑒定及培養(yǎng)條件研究

張榮嶺 王瑞明 李丕武

D-氨 基 半 乳 糖（D-Galactosamine）， 又 稱 2-氨基-2-脫氧-D-半乳糖、半乳糖胺或軟骨糖胺（Chondrosamine），廣泛存在于寡糖、糖蛋白和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）中。20世紀(jì)50年代首次發(fā)現(xiàn)其有細(xì)胞毒作用［1］，但對(duì)其特異性致肝損傷機(jī)制尚不清楚。最早認(rèn)為氨基半乳糖能競(jìng)爭(zhēng)性捕捉UTP生成二磷酸尿苷半乳糖（UDP-galactose，UDP-gal），使磷酸尿苷耗竭，影響了肝細(xì)胞的能量代謝及阻礙了核酸、糖蛋白、脂糖合成［2］。但隨著研究手段和方法的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)它與肝細(xì)胞膜的完整性、谷胱甘肽耗竭及腫瘤壞死因子有關(guān)［3］。在肝炎藥物藥效學(xué)研究中，用氨基半乳糖制作的肝損傷模型比用四氯化碳、乙醇、撲熱息痛等藥物制作的模型優(yōu)越［4］。如何合理地利用新的科學(xué)技術(shù)手段，研究其肝損傷的靶向性和毒理學(xué)機(jī)制，作為藥物研究或新類似物合成治療肝臟腫瘤等，是未來(lái)氨基半乳糖毒理學(xué)研究的方向。然而，D-氨基半乳糖國(guó)際市場(chǎng)價(jià)格昂貴，限制了國(guó)內(nèi)外肝炎治療新藥篩選用理想動(dòng)物模型的建立。

目前，D-氨基半乳糖主要是以硫酸軟骨素為原料直接用鹽酸水解后，經(jīng)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂分離提純制得的鹽酸鹽［5］。該法存在原料來(lái)源不足、工藝復(fù)雜、環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題，限制了氨基半乳糖的規(guī)模化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法研究進(jìn)展緩慢，直到2001年McGeary等［6］采用苯甲酸鈉和三甲磺酸與氨基葡萄糖反應(yīng)，合成D-氨基半乳糖。因其工藝復(fù)雜，產(chǎn)物穩(wěn)定性差、成本高等原因未能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。原核生物的糖酵解過(guò)程中，少量的6-磷酸果糖在6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶（GFAT）作用下，由谷氨酰胺提供氨基，生成6-磷酸氨基葡萄糖，在變位酶作用下生成1-磷酸氨基葡萄糖并立即乙?；蒒-乙酰-氨基葡萄糖。隨后生成中間產(chǎn)物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖并在UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶（GNE）的作用下異構(gòu)化生成UDP-N-乙酰氨基半乳糖（UDP-GalNAc）［7］。在酸性環(huán)境下脫掉乙?；玫桨被肴樘?。利用微生物以糖質(zhì)為原料轉(zhuǎn)化生成氨基半乳糖在此前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究從東營(yíng)黃河口濕地一處富含魚蟹腐爛物的淤泥中分離篩選獲得一株產(chǎn)氨基半乳糖的細(xì)菌，分析其形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列，旨在為氨基半乳糖的生物制造提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 東營(yíng)黃河口濕地，黃海深海淤泥，青島沿海某漁場(chǎng)附近地表下2cm土樣。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）富集培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基；（2）篩選培養(yǎng)基（g/L）：鹽溶液Ⅰ：NH4Cl 10，NaCl 10，Na2HPO415，KH2PO45，蒸餾水980mL；鹽溶液Ⅱ：1mol/L的MgSO4溶液；鹽溶液Ⅲ：1mol/L的CaCl2溶液；葡萄糖溶液：20％的葡萄糖；配制方法：將鹽溶液Ⅰ在1×105Pa滅菌20min，冷卻后向鹽溶液Ⅰ中添加2mL經(jīng)濾膜過(guò)濾后的鹽溶液Ⅱ和0.1mL鹽溶液Ⅲ以及20mL葡萄糖溶液。（3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：同篩選培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 分離篩選 采集樣品經(jīng)富集后，分別以LB培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基為細(xì)菌、放線菌、霉菌分離培養(yǎng)基，采用梯度稀釋法和平板劃線法分離并純化菌種。將濾紙滅菌后放置于2％的水瓊脂平板中，用0.5-1.0mL的篩選培養(yǎng)基浸濕濾紙。將純化的菌株點(diǎn)種到濾紙上，37℃恒溫培養(yǎng)1d。將濾紙片取出晾干，噴灑0.2％的茚三酮溶液，95℃顯色15min。觀察點(diǎn)樣點(diǎn)及周圍有無(wú)紫紅色［8］。將顯色的菌株接入裝有50mL篩選培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，搖床培養(yǎng)1d。將發(fā)酵液5000r/min離心3min。取上清液10mL，調(diào)pH至7.0。分別用薄層層析（TLC）法、比色法和高效液相色譜法檢測(cè)，將產(chǎn)生氨基半乳糖的菌株進(jìn)行多次連續(xù)傳代，保留產(chǎn)氨基半乳糖性能穩(wěn)定的菌株并做進(jìn)一步研究。

1.2.2 氨基半乳糖檢測(cè) （1）薄層層析（TLC）法［9］：展層劑的組成為吡啶∶乙酸乙酯∶水∶乙酸 =5∶5∶3∶1［10］，點(diǎn)樣 25μL 后展開，待展層劑揮發(fā)后均勻噴灑0.2％的茚三酮溶液，95℃顯色15min。（2）比色法［10，11］：按TLC法展開5次，將樣點(diǎn)摳出并溶于1.0mL蒸餾水中。取0.4mL樣液加入0.3mL乙酰丙酮試液Ⅰ，混勻于100℃水浴30min，放冷，加入對(duì)二甲氨基苯甲醛試液1mL，5min后在535nm處測(cè)光吸收值A(chǔ)h。同樣取0.4mL樣液加入乙酰丙酮試液Ⅱ，混勻于25℃水浴中加熱2h，加1mL對(duì)二甲氨基苯甲醛試液，混勻后在50℃下保溫15min。取出在室溫下放置30min后于530nm處測(cè)光吸收值A(chǔ)l。以蒸餾水做空白對(duì)照。兩種光吸收值比值A(chǔ)h/Al≈1時(shí)為氨基半乳糖，Ah/Al≈10時(shí)為氨基葡萄糖。（3）高壓液相色譜（HPLC）法［12，13］：HPLC分析條件：色譜柱：Inertsil NH2（4.6mm×250mm，0.5μm），檢測(cè)器為島津RID-10A，流動(dòng)相為乙腈∶水=7∶3（V/V），流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL。樣品處理：0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾。（4）氨基半乳糖含量的檢測(cè)：用高效液相色譜法檢測(cè)，色譜條件同（3）。

1.2.3 菌種鑒定 對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)及生理生化試驗(yàn)［14，15］，結(jié)合伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)和16S rDNA同源序列比對(duì)鑒定菌種。16S rRNA相似性分析采用細(xì)菌通用引物，正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。PCR 體系：Pfu體系，dNTP 4μL，5×buffer 5μL，引物Ⅰ 0.5μL，引物Ⅱ 0.5μL，模板1μL，Pfu酶1μL，ddH2O 33μL。PCR 程序設(shè)定：94℃ 5min；94℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 2.5min，35個(gè) 循 環(huán)；72℃ 10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用 BLAST軟件比對(duì)進(jìn)行序列相似性分析，從GenBank 選取相關(guān)菌種的同源序列，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-jointing算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化 （1）在培養(yǎng)條件不變的基礎(chǔ)上，按4g/L的添加量，分別用半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖替換培養(yǎng)基中的葡萄糖，以10g/L的添加量，分別用牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4NO3、氨水替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的NH4Cl，按1.2.2（4）中的方法檢測(cè)氨基半乳糖，做3個(gè)平行試驗(yàn)，確定最佳碳源和氮源。（2）培養(yǎng)基成分的正交試驗(yàn)優(yōu)化，選擇最佳碳源和氮源以及4種無(wú)機(jī)鹽Na2HPO4、CaCl2、MgSO4、KH2PO4共6個(gè)因素，設(shè)置5個(gè)水平，選用L25（56）正交表（表1），做3個(gè)平行試驗(yàn)，按1.2.2（4）中的方法檢測(cè)氨基半乳糖。

表1 發(fā)酵液成分正交試驗(yàn)的因素和水平

1.2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化 在培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將菌株YR06從斜面接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在其它培養(yǎng)條件一致的情況下，設(shè)定以下4種不同培養(yǎng)條件，200r/min搖床培養(yǎng)后用1.2.2（4）中的方法測(cè)定產(chǎn)物氨基半乳糖含量。①起始pH值對(duì)氨基半乳糖產(chǎn)量的影響：用酸度計(jì)將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。②裝液量對(duì)氨基半乳糖產(chǎn)量的影響：裝液量分別調(diào)節(jié)為250mL搖瓶裝液30、40、50、60和70mL。③培養(yǎng)溫度對(duì)氨基半乳糖產(chǎn)量的影響：培養(yǎng)溫度分別調(diào)節(jié)為30℃、33℃、35℃、37℃和40℃。④培養(yǎng)時(shí)間對(duì)氨基半乳糖產(chǎn)量的影響：在上述優(yōu)化的條件下，培養(yǎng)過(guò)程中每隔2h取樣一次，測(cè)定發(fā)酵液OD600并用1.2.2（4）的方法測(cè)定氨基半乳糖含量。

2 結(jié)果

2.1 氨基半乳糖生產(chǎn)菌株的篩選

經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)，分離純化出單菌落139株，初篩中得到24株顏色反應(yīng)成紅色及紫紅色的菌株，復(fù)篩得到1株產(chǎn)氨基半乳糖的菌株YR06，產(chǎn)量為63.5mg/L。將該菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)一步研究。薄層層析結(jié)果顯示與氨基半乳糖標(biāo)樣的比移值相同（圖1）。比色法（Ah/Al≈1）和高效液相色譜（圖2）檢測(cè)并確認(rèn)產(chǎn)物為氨基半乳糖。

圖1 發(fā)酵液的薄層層析圖

圖2 粗提液的液相色譜圖

2.2 經(jīng)典分類學(xué)特征

菌株YR06在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，37℃培養(yǎng)12h，形成邊緣整齊、表面濕潤(rùn)、中央隆起、光滑、半透明、淡黃色的圓形菌落（圖3-A）。發(fā)酵液有芳香氣味。 兩端鈍圓，直形短桿菌，革蘭氏染色為陰性，單個(gè)或成對(duì)排列，無(wú)芽孢（圖3-B）。生理生化試驗(yàn)特征見表2。

2.3 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)16S rDNA測(cè)序，其堿基數(shù)為1 451bp，將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，多序列連配分析后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)YR06與氣單胞菌的多個(gè)種16S rDNA序列相似性達(dá)到99％，與嗜水氣單胞菌位于同一分支。

圖3 菌株YR06菌落形態(tài)（24h）（A）及革蘭氏染色（24h，1 600×）（B）

表2 菌株YR06的生理生化特征

圖4 菌株YR06的16S rDNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹圖

綜合考慮YR06的形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步鑒定菌株YR06屬于嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila），將其命名為A.hydrophila YR06。

2.4 菌株YR06培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 不同碳、氮源對(duì)A.hydrophila YR06產(chǎn)氨基半乳糖的影響 以葡萄糖等6種碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株A.hydrophila YR06，均有氨基半乳糖產(chǎn)生，其中以果糖為碳源時(shí)產(chǎn)量最大。其次是葡萄糖，而半乳糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖果較差（圖5）。因此，以果糖為碳源。以牛肉膏等8種氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)YR06，以尿素為氮源時(shí)產(chǎn)量最大，以NaNO3、NH4NO3為氮源時(shí)產(chǎn)量最小（圖6），因此以尿素為氮源。

2.4.2 培養(yǎng)基成分的正交試驗(yàn) 以果糖、尿素、CaCl2、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4為因素，按 L25（56）正交表設(shè)計(jì)6因素5水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化菌株YR06產(chǎn)氨基半乳糖的發(fā)酵液成分（表3）。正交試驗(yàn)極差分析表明，6個(gè)因素對(duì)氨基半乳糖產(chǎn)量的影響為A＞D＞B＞F＞E＞C，方差分析表明，果糖添加量對(duì)菌株YR06發(fā)酵產(chǎn)氨基半乳糖產(chǎn)量影響最大。最優(yōu)組合為A4B3C3D4E2F3；因此確立培養(yǎng)基配方為：果糖（10g/L）、 尿 素（15g/L）、Na2HPO4（15g/L）、Ca-Cl2（22.2g/L）、MgSO4（0.18g/L）、KH2PO4（5g/L）。

2.4.3 菌株YR06產(chǎn)氨基半乳糖培養(yǎng)條件的優(yōu)化在確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，將培養(yǎng)基的初始pH調(diào)節(jié)為6.5，250mL三角瓶裝60mL發(fā)酵液，33℃，200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)14h，氨基半乳糖產(chǎn)量最高，達(dá)到128mg/L。因此選擇此培養(yǎng)條件為發(fā)酵培養(yǎng)條件。

圖5 不同碳源對(duì)氨基半乳糖產(chǎn)量的影響

圖6 不同氮源對(duì)氨基半乳糖產(chǎn)量的影響

3 討論

傳統(tǒng)生產(chǎn)氨基半乳糖的方法不僅原料少，而且生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生大量的廢水，污染環(huán)境，產(chǎn)物提純也較復(fù)雜，因此，利用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)氨基半乳糖必將會(huì)成為未來(lái)最具競(jìng)爭(zhēng)力的生產(chǎn)方法，實(shí)現(xiàn)這一生產(chǎn)方法的核心是能夠高效積累氨基半乳糖的菌種。龔霞等［16］采用抑制差減法從嗜水氣單胞菌中雜交得到gneJ片段，擴(kuò)增后并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，重組表達(dá)蛋白可將UDP-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-乙酰氨基半乳糖，證實(shí)gneJ基因編碼蛋白為UDP-乙酰氨基葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶。本研究篩選得到的高產(chǎn)氨基半乳糖菌株經(jīng)鑒定為嗜水氣單孢菌（A.hydrophila YR06），而目前對(duì)嗜水氣單胞菌的研究主要集中在致病性、耐藥性以及疫苗等方面，尤其是對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的危害及防治方面。未見有這類菌株積累氨基半乳糖方面的報(bào)道。從液相圖譜可以看出，該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物相對(duì)單一，易于分離，具有較好的工業(yè)化開發(fā)價(jià)值。

表3 菌株YR06產(chǎn)氨基半乳糖培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)基優(yōu)化過(guò)程中，果糖作為最適碳源出現(xiàn)，其原因可能是果糖和葡萄糖的代謝途徑具有高度的相似性，嗜水氣單胞菌的糖代謝途徑中存在著果糖激酶，該酶受葡萄糖介導(dǎo)的抑制并受果糖誘導(dǎo)，將果糖變?yōu)?6-磷酸果糖［17］。同時(shí)，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖在GNE作用下異構(gòu)化為UDP-N-乙酰氨基半乳糖并最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的6-磷酸氨基葡萄糖無(wú)法大量積累而減弱了6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶的限速作用，該途徑得以持續(xù)進(jìn)行。Mg2+是許多酶活性中心必不可少的一部分，能夠保證菌體的良好生長(zhǎng)。同時(shí)，添加Mg2+能有效的激活谷氨酰胺合成酶的活性，提高谷氨酰胺的生成量［18］。Ca2+對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量的影響可能是影響了細(xì)胞膜的透性，使得產(chǎn)物可透過(guò)細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外部，減弱了對(duì)關(guān)鍵酶的反饋抑制作用。

氨基半乳糖轉(zhuǎn)化菌株的篩選和分類鑒定工作對(duì)于氨基半乳糖生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)工藝的建立有重要意義。通過(guò)基因工程等手段將編碼氨基半乳糖轉(zhuǎn)化的基因?qū)肫渌?，同時(shí)切斷菌株將氨基半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的途徑，使之不能再降解氨基半乳糖，有利于持續(xù)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)中產(chǎn)物的累積，實(shí)現(xiàn)其高效安全生產(chǎn)。因此，有必要對(duì)菌株YR06進(jìn)行進(jìn)一步育種及馴化培養(yǎng)等研究。

4 結(jié)論

從黃河口濕地一處富含魚蟹腐爛物的淤泥中篩選到一株具有氨基半乳糖轉(zhuǎn)化能力的菌株，菌株YR-06鑒定為嗜水氣單胞菌。優(yōu)化該菌株的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件：果糖10g/L，尿素15g/L，Na2HPO415g/L，CaCl222.2g/L，MgSO40.18g/L，KH2PO45g/L；發(fā)酵液初始pH6.5，裝液量為60mL/250mL，溫度為33℃，培養(yǎng)時(shí)間14h。氨基半乳糖的產(chǎn)量達(dá)到128mg/L。

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