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    牛樟葉水提物對(duì) D-半乳糖致衰老模型小鼠的作用機(jī)制研究*

    2021-02-24 10:31:10余瀟苓萬永艷梁學(xué)政覃開羽
    中國(guó)藥業(yè) 2021年3期
    關(guān)鍵詞:勻漿半乳糖腦組織

    張 蓓,余瀟苓,萬永艷,梁學(xué)政,覃開羽△

    (1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)醫(yī)院,廣西 柳州 545026; 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 杭州 310006)

    牛樟 Cinnamomum Kanehirae Hayata分布在中國(guó)南部,為臺(tái)灣特有樹種,近年來被中國(guó)大陸地區(qū)多地引進(jìn)栽培。其根、皮、果、葉均可入藥,但功效略有不同,牛樟葉的功效以祛風(fēng)除濕、止痛、殺蟲為主[1]?,F(xiàn)代研究主要以牛樟的無性繁殖、引種栽培、生長(zhǎng)特性和分子鑒定為主[2-3],藥學(xué)部分僅見牛樟葉精油成分研究,未見藥理和化學(xué)成分的報(bào)道[4]。衰老是生物生命周期的重要組成部分,是任何生命活動(dòng)的必然規(guī)律,雖不可阻滯,但可延遲。隨著世界人口老齡化的加快,探討延緩衰老作用機(jī)制和抗衰老研究已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門課題之一。自由基理論是衰老機(jī)制的重要理論之一,以氧化應(yīng)激為特點(diǎn)的氧化還原失衡是衰老的重要病理進(jìn)程[5-6]。多糖類物質(zhì)是抗衰老的活性成分[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),牛樟葉富含多糖成分,但尚未闡明牛樟葉多糖延緩衰老的藥效和作用機(jī)制。本研究中建立 D-半乳糖衰老小鼠模型,以抗氧化相關(guān)酶為指標(biāo),探討了牛樟葉水提物(AECL)的抗衰老作用及其作用機(jī)制?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

    儀器:Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司);ME204E型分析電子天平(梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司,精度為0.01 mg);UV1780-5型紫外分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理<中國(guó)>有限公司);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,功率為240 W,頻率為 40 kHz,轉(zhuǎn)速為 500 ~5 000 r/min)。

    試藥:維生素E(桂林南藥股份有限公司,批號(hào)為VE181101);D-半乳糖(上海惠興生化試劑有限公司,批號(hào)為120214)。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào)為20190815),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號(hào)為 20190414),一氧化氮 (NO)試劑盒(批號(hào)為20181114),總抗氧化能力 (T-AOC)試劑盒(批號(hào)為20190801),過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號(hào)為20190719),BCA 試劑盒(批號(hào)為 20190815),均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。牛樟葉由柳州市天姿園藝有限公司提供,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊柯教授鑒定為正品,標(biāo)本保存于廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部標(biāo)本室。

    動(dòng)物:清潔級(jí) KM 小鼠 60 只,體質(zhì)量(20±2)g,雌雄各半,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度 60% ~65% ,明暗 12 h/12 h交替,分籠飼養(yǎng),給予標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由進(jìn)食、飲水。

    1.2 方法

    1.2.1 衰老動(dòng)物模型建立

    每天于小鼠頸背部皮下注射 D-半乳糖100 mg/kg,連續(xù)造模20 d后,每周周一、周四按相同方法造模2次,共 3 周[8]。

    1.2.2 分組及給藥

    稱取干燥牛樟葉10 kg,按物料30倍、20倍加水,加熱提取3次,每次3 h,合并3次濾液,常壓加熱,濃縮至流浸膏,分裝,4℃冰箱冷藏保存,備用,流浸膏1 g相當(dāng)于8.805 g牛樟葉,即得AECL。取造模后10 d的KM小鼠,雌雄各半,按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,即模型組(B組),陽性對(duì)照組(C 組,維生素 E,200mg/kg),AECL 高、中、低劑量組[D1組、D2組、D3組,給藥劑量相當(dāng)于每1kg體質(zhì)量20,10,5 g(生藥)],每組 10 只;另取 10 只同批健康 KM種小鼠,雌雄各半,作為正常對(duì)照組(A組)。C組和D1,D2,D3組灌胃給藥,每日2次,連續(xù)30 d,A組和B組給予等體積生理鹽水。末次給藥2 h后,摘取眼球取血,分離血清,立即處死動(dòng)物,剖取肝臟、心臟、腎臟、腦。

    1.3 觀察指標(biāo)

    分離血清和肝、心、腎、腦組織勻漿后,嚴(yán)格按試劑盒說明書方法檢測(cè)相應(yīng)組織器官的SOD,GSH-Px,CAT,T-AOC,NO 水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

    D-半乳糖干預(yù)5周后,小鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩,皮毛逐漸無光澤和變灰色,體質(zhì)量逐漸下降,表現(xiàn)出明顯的衰老特征。與A組比較,B組小鼠血清中SOD,GSH-Px,T-AOC水平均明顯下降(P<0.05),表明成功構(gòu)建D-半乳糖衰老小鼠模型。與B組比較,C組、D1組、D2組小鼠血清中SOD和GSH-Px水平均明顯升高,C組、D1組 SOD,GSH-Px,T-AOC水平差異均顯著升高(P <0.05)。詳見表 1。

    表1 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠血液生化指標(biāo)的影響(±s,n=10)Tab.1 Effect of AECL on blood biochemical indexes of D-galactose-induced aging mice(±s,n=10)

    表1 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠血液生化指標(biāo)的影響(±s,n=10)Tab.1 Effect of AECL on blood biochemical indexes of D-galactose-induced aging mice(±s,n=10)

    注:與A組比較,#P<0.05;與B組比較,*P<0.05。下表同。Note:Compared with those in group A,#P < 0.05;compared with those in group B,*P < 0.05;as well as the following tables.

    組別 劑量(g/kg)SOD(U/mL)GSH-Px(U)T-AOC(mmol/L A組B組C組D1組D2組D3組0.20 20 10 5 16.16±3.36 12.13±2.62#16.40±4.22*15.32±3.12*14.65±3.03*11.52±2.03 240.17±31.43 215.69±19.07#243.97±36.23*233.28±17.22*236.72±28.67*236.72±32.69)2.83±0.06 2.73±0.09#2.82±0.06*2.80±0.06*2.73±0.09 2.69±0.06

    表2 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠肝臟、心臟SOD和CAT及腎臟SOD的影響(±s,U/μg pro,n=10)Tab.2 Effect of AECL on the levels of SOD and CAT in liver and heart,the level of SOD in kidney of D-galactose-induced aging mice(±s,U/μg pro,n=10)

    表2 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠肝臟、心臟SOD和CAT及腎臟SOD的影響(±s,U/μg pro,n=10)Tab.2 Effect of AECL on the levels of SOD and CAT in liver and heart,the level of SOD in kidney of D-galactose-induced aging mice(±s,U/μg pro,n=10)

    組別 劑量(g/kg) 肝組織 心臟 腎臟SOD A組B組C組D1組D2組D3組0.20 20 10 5 SOD 27.85±1.23 21.43±2.58#26.69±2.60*29.91±1.69*32.24±2.26*32.34±2.48*CAT 197.87±92.93 113.22±34.21#221.58±86.01*215.46±110.43*220.19±135.48*220.79±130.33*SOD 35.43±18.00 20.13±11.51#39.14±25.96*42.69±36.92 80.14±79.91*30.13±19.39 CAT 93.91±44.58 56.66±48.07 103.71±59.18 138.33±86.22*128.08±107.45 64.56±51.14 321.25±54.42 259.05±41.77#294.45±34.87 305.35±35.60*296.29±33.48*287.31±39.7

    2.2 對(duì)肝臟SOD和CAT的影響

    與A組比較,B組小鼠肝組織勻漿中SOD和CAT活性均明顯降低(P<0.05),表明 D-半乳糖衰老小鼠肝臟抗氧化能力下降;與B組比較,C組、D1組、D2組、D3組小鼠肝組織勻漿中SOD和CAT水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見表2。

    2.3 對(duì)心臟SOD和CAT水平的影響

    與A組比較,B組小鼠心臟組織勻漿中SOD水平明顯降低(P<0.05),CAT水平有降低趨勢(shì),但無顯著差異(P>0.05);與B組比較,C組、D2組小鼠心臟組織勻漿中SOD水平均顯著升高(P<0.05),D1組CAT水平顯著升高(P<0.05),表明AECL能顯著提高衰老小鼠心臟的抗氧化能力。詳見表2。

    2.4 對(duì)腎臟SOD的影響

    與A組比較,B組小鼠腎臟組織勻漿SOD水平明顯降低(P<0.05);與B組比較,D1組、D2組小鼠腎臟組織勻漿中SOD水平均顯著升高(P<0.05)。詳見表2。

    2.5 對(duì)腦組織SOD,GSH-Px,NO的影響

    與A組比較,B組小鼠腦組織勻漿中SOD,GSH-Px,NO水平均明顯降低(P<0.05);與B組比較,C組、D1組小鼠腦組織勻漿中NO水平均顯著升高(P<0.05),SOD和GSH-Px水平均呈升高趨勢(shì),但無顯著差異(P >0.05)。詳見表 3。

    表3 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠腦組織指標(biāo)影響(±s,n=10)Tab.3 Effect of AECL on brain tissue indexes ofD-galactoseinduced aging mice(±s,n=10)

    表3 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠腦組織指標(biāo)影響(±s,n=10)Tab.3 Effect of AECL on brain tissue indexes ofD-galactoseinduced aging mice(±s,n=10)

    組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量(g/kg)0.20 20 10 5 SOD(U/μg pro)42.30±2.55 28.65±9.24#33.53±7.95 33.14±7.52 32.17±7.80 33.68±7.98 GSH-Px(活力單位 /μg pro)148.48±50.52 104.37±29.65#136.65±46.81 123.37±30.61 117.79±39.50 112.19±40.19 NO(μmol/L)14.21±8.96 6.64±5.46#23.32±12.04*16.03±8.06*10.07±7.60 10.32±6.01

    3 討論

    研究表明,機(jī)體衰老與氧化應(yīng)激密切相關(guān),生化指標(biāo)測(cè)定一般多集中在氧化應(yīng)激相關(guān)酶的測(cè)定[9]。SOD,CAT,GSH-Px可清除超氧陰離子,維持機(jī)體氧化還原平衡[10]。

    本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,藥物干預(yù)組動(dòng)物血清的 T-AOC,SOD,CAT,GSH-Px生化指標(biāo)均明顯改善,表明AECL有抗衰老作用。SOD調(diào)節(jié)活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)的水平,減少對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的損害[11]。本研究中,AECL明顯提高衰老模型小鼠肝臟、腎臟和心臟勻漿的SOD水平,加快ROS的清除,維持機(jī)體的氧化還原平衡。CAT負(fù)責(zé)將SOD催化生成的過氧化氫轉(zhuǎn)化成氧分子,降低過氧化氫濃度,促進(jìn)超氧陰離子的清除[12]。本研究中,AECL處理后,衰老模型小鼠心臟和肝臟勻漿的CAT水平明顯升高,抗氧化能力增強(qiáng)。NO可通過隔離鐵離子的方式發(fā)揮抗氧化作用[13],可通過調(diào)節(jié)SOD活性發(fā)揮抗氧化作用[14]。AECL可提高心臟SOD水平,D2組小鼠SOD水平明顯高于D1組和D3組。由于中藥具有多靶點(diǎn)、多組分的特點(diǎn),各活性成分間又存在協(xié)同作用及拮抗作用。因此,量效曲線可能呈鐘形曲線。AECL處理 D-半乳糖衰老小鼠后,小鼠腦組織勻漿中NO水平明顯上升,AECL的抗衰老作用可能與提高腦組織NO水平有關(guān);腦組織勻漿中SOD和GSH-Px水平并未顯著改善,但影響心臟和腎臟中SOD水平,肝臟、心臟勻漿CAT水平及腦組織勻漿中NO水平的詳細(xì)作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,AECL具有一定的延緩衰老作用,其作用機(jī)制可能與提高肝臟、心臟、腎臟和腦組織的抗氧化能力有關(guān),但詳細(xì)作用機(jī)制需要作進(jìn)一步探討。

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