免疫檢查點分子聯(lián)合CAR-T細胞治療實體腫瘤研究進展

馮琛 綜述；蔣敬庭 審閱（蘇州大學(xué)a.附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心；b.細胞治療研究院，江蘇 常州 213003）

嵌合抗原受體修飾的T 細胞（CAR-T）免疫療法是指通過生物工程技術(shù)方式，以患者T 細胞為基礎(chǔ)，構(gòu)建包含靶向特異性靶點嵌合抗原受體（CAR）的ScFv 片段，而后兩者組裝，完成人工構(gòu)建CAR-T 細胞。通過人工構(gòu)建的CAR-T 細胞精準靶向腫瘤細胞，T 細胞局限性釋放IL-6 等多種抑瘤細胞因子，精準、高效治療腫瘤的治療方式。免疫檢查點分子是一組存在于免疫細胞表面的調(diào)控分子，在生理狀態(tài)下，免疫檢查點分子承擔著維持自身免疫系統(tǒng)耐受和維持免疫穩(wěn)態(tài)的角色。常見的免疫檢查點分子包括程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）、細胞毒性T 淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）等。血液系統(tǒng)腫瘤CAR-T治療已取得了一定進展，但針對實體腫瘤的CAR-T 技術(shù)研究尚未完善。本文就免疫檢查點分子聯(lián)用CAR-T免疫療法在實體腫瘤治療研究中的新進展進行綜述。

1 CAR-T療法在實體腫瘤治療中的運用與挑戰(zhàn)

CAR-T常包括胞外特異性識別腫瘤抗原的單鏈可變片段ScFv、T細胞胞膜上識別區(qū)域和T細胞膜內(nèi)的效應(yīng)區(qū)。RAJ等[1]通過構(gòu)建可轉(zhuǎn)變的ScFv片段，此ScFv 片段特異性靶向胰腺導(dǎo)管癌的HER-2 區(qū)域，從而達到了提高靶向準確度，減少T細胞“誤殺”行為的目的?，F(xiàn)階段常用的CAR-T 技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第三代。三代CAR-T 技術(shù)主要區(qū)別在人工構(gòu)建的CAR刺激區(qū)域的不同。其中，第一代CAR 結(jié)構(gòu)為最基礎(chǔ)的CAR結(jié)構(gòu)，一般情況是指特異性識別的ScFv片段直接與CD3ζ區(qū)域相結(jié)合?；贑D3ζ的第一代CAR激活T 細胞有可能是通過酪氨酸免疫受體活化基序（ITAM）調(diào)控的[2]。第一代CAR-T技術(shù)構(gòu)建的T細胞活化程度不足，相對持久性較差。第二代CAR 構(gòu)建方式是在第一代基礎(chǔ)上加入了T 細胞活化區(qū)域，如CD28 或4-1BB（CD137）。有學(xué)者[3]證實在急性淋巴瘤的腫瘤模型中，通過構(gòu)建靶向CD19-CAR-T細胞同時加入CD28 共刺激區(qū)域構(gòu)建的二代CAR-T 細胞可有效加強CAR-T的抑瘤效果。與此同時，也有學(xué)者[4]通過在靶向前列腺特異性膜抗原的CAR 中添加了CD28 共刺激區(qū)域，可有效重定向和放大抑瘤因子（IL-2）的釋放效果。一項針對共刺激CD28與4-1BB的研究[5]中指出，相較于共刺激CD28 的CAR-T 構(gòu)建策略，選擇共刺激4-1BB 區(qū)域可相對有效提高CAR-T細胞的體內(nèi)持久性，且這種對T細胞的“升級”有可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB實現(xiàn)的。第三代CAR-T技術(shù)是指在構(gòu)建CAR-T 細胞時加入CD28 和4-1BB 共刺激區(qū)域。理想狀態(tài)下，通過共刺激CD28 和4-1BB區(qū)域可同時提高改造T 細胞的效率和持久性。在治療霍奇金淋巴瘤臨床試驗[6]中證實，相較于第二代CAR-T 細胞，新構(gòu)建策略的第三代CAR-T 細胞表現(xiàn)出更好的持久性和抗腫瘤活性。此外，有學(xué)者[7]提出，通過共刺激CD28 和4-1BB 區(qū)域，可有效提高CAR-T 細胞的增殖能力，并通過胰腺癌異位成瘤的CAR-T研究顯示，第二代CAR-T相較于第三代CAR-T表現(xiàn)出更好的誘導(dǎo)抗腫瘤因子的特性。為了探究誘導(dǎo)差異的原因，有學(xué)者[8]通過質(zhì)譜分析的方法探究出相較于第三代CAR-T細胞，僅共刺激CD28的第二代CAR-T 細胞有更好的誘導(dǎo)特性，此現(xiàn)象有可能是與激活的磷酸化CD3ζ有關(guān)。

迄今為止，CAR-T 療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療策略的研究中已展現(xiàn)了極好的運用價值。如以患者自身CD4+T 和CD8+T 細胞為基礎(chǔ)，構(gòu)建靶向CD19的CAR 的ScFv 片段，靶向組裝完成的CD9-CAR-T細胞已被用于B 細胞來源的急性淋巴細胞白血病的臨床試驗中，并采用流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，通過CAR-T 的治療可使90%的患者達到緩解狀態(tài)[9]。因此，在實體腫瘤治療領(lǐng)域，CAR-T 技術(shù)存在研究潛力。

這種治療效果的差異可能與實體腫瘤的獨特特征有關(guān)。與血液系統(tǒng)腫瘤相比，實體腫瘤多表現(xiàn)為實體腫瘤細胞靶點多呈現(xiàn)出多樣性、實體腫瘤的T細胞浸潤程度較弱及微環(huán)境多表現(xiàn)抑制T 細胞行為等特征[10]。首先，相較于血液系統(tǒng)腫瘤高表達CD19 的特征不同，實體腫瘤常因組織來源不同等多種原因表現(xiàn)為高度的抗原異質(zhì)性?，F(xiàn)階段實體腫瘤CAR-T靶點的選擇策略通常是尋找特異性腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。例如，黏蛋白1（mucin-1，MUC1/CD277）作為TAA已經(jīng)使用在實體腫瘤CAR-T上。有課題組[11]使用HMFG2-ScFv 構(gòu)建第一代和第二代MUC1 特異性CAR-T 細胞，且為了確保CAR-T 細胞在實體腫瘤微環(huán)境中的穩(wěn)定表達及增殖，該課題組共表達連接IL-7 的IL-4 受體區(qū)域的反向細胞因子受體（inverted cytokine receptor，ICR）。體內(nèi)外實驗證實，在IL-4/-7 ICR 共表達的情況下，第二代CAR-T 相較于第一代CAR-T 技術(shù)表現(xiàn)出對腫瘤的有效抑制性，且針對腫瘤微環(huán)境這種腫瘤抑制性表現(xiàn)更為優(yōu)秀。在頭頸部腫瘤的治療研究中，靶向MUC1 的CAR-T 細胞可以賦予腫瘤特異性免疫力，且在外源性添加IL-22 重組蛋白時，可有效增強CAR-T 細胞功能[12]。與此同時，MUC1 亦可作為胰腺癌[13]、非小細胞肺癌[14]、前列腺癌[15]CAR-T 治療的靶點。其次，在實體腫瘤環(huán)境中，嵌合抗原改造后的T細胞腫瘤浸潤效果及歸巢效果較差。在血液系統(tǒng)中，CAR-T 細胞與腫瘤細胞共處于同一物理環(huán)境中，相對來說，不存在T細胞浸潤和歸巢困難的問題。但當處于實體腫瘤微環(huán)境時，趨化因子軸不匹配和高內(nèi)皮小靜脈（HEV）幼稚化[16]有可能是影響效應(yīng)T細胞腫瘤歸巢的因素。人生長調(diào)節(jié)癌基因-α（growth-regulated oncogene-α,CXCL1/Gro-α）在多種腫瘤細胞上均有分泌。有學(xué)者[17]把CXCL1 作為目標趨化因子，通過使用編碼CXCL1 受體的慢病毒轉(zhuǎn)染T 細胞，證實此基因可加強T 細胞分泌IFN-γ，更重要的是此基因可通過整合趨化因子軸的方式從而有效加強T細胞歸巢的效果。最后，不同于血液惡性腫瘤微環(huán)境，實體腫瘤的微環(huán)境常表現(xiàn)為低氧、低糖的狀態(tài)[18]。腫瘤微環(huán)境的低糖狀態(tài)有可能會影響效應(yīng)T 細胞的活性，且阻斷PD-1 可抑制葡萄糖代謝相關(guān)的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）活性達到降低糖酵解酶表達的作用[19]。

2 免疫檢查點PD-1聯(lián)用CAR-T技術(shù)

程序性死亡分子-1（PD-1，CD279）與其配體PD-L1（B7-H1，CD274）相結(jié)合后，激活可導(dǎo)致T細胞的衰減和功能障礙[20]。在腫瘤的發(fā)生及進展過程中，腫瘤細胞可表達PD-L1。腫瘤細胞可利用該免疫檢查點的負調(diào)節(jié)機制，靶向結(jié)合效應(yīng)T細胞表面的PD-1抑制T細胞，達到免疫逃逸的效果[21]。近年來，眾多學(xué)者期望通過多種抑制劑靶向抑制PD-1 及PD-L1 分子，從而達到抑制腫瘤免疫逃逸。多個研究[22-25]證實，通過阻斷PD-1/PD-L1軸能夠在一定程度上達到抑制腫瘤細胞免疫逃逸及恢復(fù)T細胞的腫瘤殺傷功能的目的。但是由于免疫調(diào)節(jié)的復(fù)雜性及惡性腫瘤的異質(zhì)性，免疫檢查點抑制劑單藥抑制腫瘤的效果欠佳。PD-1/PD-L1 抑制劑的臨床試驗[26]分析顯示，接受PD-1/PD-L1 抑制劑治療的患者中，60%以上患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，因此，研究聯(lián)用CAR-T技術(shù)在內(nèi)的多藥物聯(lián)合治療策略具有重要意義。

PD-1調(diào)控聯(lián)合CAR-T的研究策略主要針對構(gòu)建單獨靶向或聯(lián)合靶向PD-1的CAR-T細胞；構(gòu)建小范圍分泌PD-1抑制劑的CAR-T細胞和靶向PD-1，間接性增強CAR-T與腫瘤的結(jié)合程度及增強T細胞的細胞毒性。

2.1 構(gòu)建單獨靶向或聯(lián)合靶向PD-1的CAR-T

LIU等[27]學(xué)者構(gòu)建了靶向PD-L1的CAR-T細胞，在異位成瘤的裸鼠中證實靶向PD-L1的CAR-T細胞可“根除”PD-L1高表達的非小細胞肺癌；該課題組進一步通過局部照射和抗PD-L1-CAR-T細胞聯(lián)用的方式證實此聯(lián)用可減弱低表達PD-L1 的非小細胞肺癌細胞的生長。YANG 等[28]通過慢病毒載體構(gòu)建PD-L1-CAR-T 細胞靶向PD-1，在胰腺導(dǎo)管腺癌異位模型的體內(nèi)、體外實驗中都表現(xiàn)了很好的抑制腫瘤效果，且此抑制效果有可能是通過基因修飾后T細胞高表達炎性因子實現(xiàn)的。除單獨靶向CAR-T 外，PD-1聯(lián)合靶點CAR-T構(gòu)建同樣引起關(guān)注。針對胃癌的研究中，通過構(gòu)建靶向Trop2 和PD-L1 的CAR-T[29]和靶向c-Met 和PD-1 雙靶點CAR-T 細胞[30]在體內(nèi)及體外實驗中都表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性有可能與效應(yīng)T細胞釋放IFN-γ與IL-2有關(guān)。

2.2 構(gòu)建表達PD-1 抑制劑的CAR-T 細胞小范圍分泌PD-1抑制劑精準靶向腫瘤細胞

抗PD-1/PD-L1 治療依舊是研究相對完全、臨床試驗相對完整的免疫檢查點治療方案。但除霍奇金淋巴瘤和黑色素瘤外，在絕大多數(shù)晚期癌癥患者的治療中，單一使用抗PD-1/PD-L1藥物時，患者的緩解率僅約為20%，且約66%的患者出現(xiàn)一項或一項以上的不良反應(yīng)[26,31]。有課題組[32]通過構(gòu)建識別CD19或MUC16及小鼠CD28的雙識別CAR-T并工程化改造ScFv片段，使已改造CAR-T細胞特異性結(jié)合癌細胞后通過旁分泌及自分泌兩種方式小范圍分泌PD-1抑制劑；通過體內(nèi)實驗證實，人工制備的CAR-T細胞表現(xiàn)出很好的腫瘤抑制特性，且與全身的免疫檢查點治療相比較，CAR-T 細胞分泌的ScFv 局限在局部的腫瘤微環(huán)境中，這種局部的ScFv 表達有可能在一定程度上降低了不良事件的發(fā)生概率。

2.3 通過靶向PD-1 增強CAR-T 與腫瘤的結(jié)合程度及增強T細胞的細胞毒性

有課題組[33]通過神經(jīng)母細胞瘤的臨床試驗比較了3 種聯(lián)用方案：單獨使用第三代CAR-T、第三代CAR-T 聯(lián)用環(huán)磷酰胺和氟達拉濱（Cy/Flu）、第三代CAR-T聯(lián)用環(huán)磷酰胺和氟達拉濱（Cy/Flu）及PD-1抗體，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用第三代CAR-T與化療藥物和抗PD-1三者聯(lián)用方案表現(xiàn)出更好的T細胞功能持續(xù)性及抗腫瘤抑制性，試驗結(jié)果證實，PD-1抗體聯(lián)用可能在一定程度上強化了腫瘤治療的效果。

有實驗[34]證實，在前列腺癌的異位小鼠模型中，通過聯(lián)合CAR-T和抗PD-1單克隆抗體，可以有效增強CAR-T細胞的靶向性及持久性。這種增強效果有可能與逆轉(zhuǎn)處于小鼠腫瘤結(jié)節(jié)中心的CD3+T 細胞功能限制有關(guān)。針對抗PD-1 加強CAR-T 細胞功能的機制，CHERKASSKY 等[35]通過在胸膜間皮瘤小鼠模型中聯(lián)用CAR-T 與PD-1 阻斷劑實驗證實，PD-1 阻斷劑的確可有效提高CAR-T 細胞的作用效果且這種加強有可能與恢復(fù)CD28-CAR-T 細胞的作用有關(guān)。

RUPP 等[36]為阻斷因PD-1 表達而引起的CAR-T細胞功能低下，使用結(jié)合Cas9 核糖核蛋白（Cas9 RNP）介導(dǎo)的低表達PD-1 的CAR-T 構(gòu)建方案，且證實新構(gòu)建的CAR-T 細胞表現(xiàn)出更高的腫瘤殺傷力。在一項針對肝細胞癌的研究中[37]證實，相較于野生型CAR-T 細胞，CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建的PD-1 缺失的CAR-T 細胞表現(xiàn)出更強的抗腫瘤活性，且CD4+、CD8+T 細胞亞群和CAR-T 細胞的激活狀態(tài)更加穩(wěn)定。在三陰型乳腺癌體外實驗研究[38]中發(fā)現(xiàn)，同樣通過CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建的PD-1 缺失的CAR-T 細胞，相較于野生型CAR-T細胞，也表現(xiàn)出更強的抗腫瘤活性，但與此同時對于CAR-T 細胞的增殖幾乎沒有影響。

雖然CRISPR/Cas9技術(shù)被使用在構(gòu)建PD-1缺失的CAR-T 細胞中，但是CRISPR/Cas9 技術(shù)可能引起錯義突變，加劇T 細胞功能障礙。SHI 等[39]通過單堿基ABE 編輯器技術(shù)構(gòu)建PD-1 糖基殘基化CAR-T 細胞，并證實通過ABE構(gòu)建的PD-1糖基殘基化CAR-T細胞在體內(nèi)、外具有更強的抗腫瘤效果。WEI等[40]使用shRNA技術(shù)構(gòu)建PD-1穩(wěn)定阻斷的CAR-T細胞，結(jié)果顯示，在短期PD-1阻斷的確可以增強CAR-T細胞腫瘤殺傷能力，但從長遠看，PD-1敲低會削弱CAR-T的增殖“潛力”，這種PD-1低表達有可能會影響CAR-T的治療效果；該課題組認為，PD-1的低表達有可能通過加速T細胞的早期分化并阻止T細胞分化為效應(yīng)T細胞的方式抑制T 細胞的增殖過程，并影響CAR-T的治療效果。

3 CTLA-4 調(diào)控聯(lián)合CAR-T 技術(shù)在實體腫瘤治療策略中的研究

T 細胞的活化需要“激活”及“抑制”相配合的調(diào)控。T 細胞的抑制主要是通過免疫檢查點PD-1 及CTLA-4的激活來實現(xiàn)。除PD-1外，CTLA-4同樣被認為是T 細胞表面表達的抑制性免疫檢查點之一。在T 細胞的活化過程中，CTLA-4 通過與CD80 和CD86 結(jié)合的方式以抵消T 細胞的CD28 刺激性調(diào)節(jié)作用。近年來，有學(xué)者[41]證實除T細胞外，NK細胞表面有可能同樣存在CTLA-4，通過靶向CTLA-4 抗體的形式靶向NK 細胞，從而增強了NK 細胞的抗腫瘤活性。

有研究[42-43]發(fā)現(xiàn)，激活T細胞功能的調(diào)控點CD28可共享CTLA-4 的配體CD80 及CD86。在CAR-T 技術(shù)的發(fā)展進程中，CD28的使用占有重要地位。相對于第一代CAR-T 技術(shù)，第二代CAR-T 技術(shù)是通過添加CD28 刺激區(qū)域達到增強T 細胞功能及持久性的效果。有實驗證實，通過添加共刺激域CD28區(qū)域可有效增加CAR-T 的抗腫瘤活性，但這種強效有可能伴隨CAR-T耐久性及持久性而降低。YIN等[44]證實，CTLA-4 阻斷劑與白介素13 受體α2（IL-13Rα2）及CAR-T聯(lián)用可有效加強CAR-T的抗腫瘤效果。有課題組[45]聚合CAR樣納米聚合物，將CD28RNA適體和CTLA-4RNA適體形成四聚體，再把其置于穩(wěn)定的核酸三相支架中，結(jié)果顯示，合成物可特異性識別CD28 及CTLA-4，同時通過小鼠黑色素瘤體內(nèi)實驗也證實該合成物可履行CAR-T的功能。

4 展 望

CAR-T 靶向治療癌癥因其高效性、靶向性和特異性而受到關(guān)注。此技術(shù)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中展現(xiàn)了精準的癌細胞靶向性及良好的治療效果。與血液系統(tǒng)惡性腫瘤不同，實體腫瘤存在多樣性的表面抗原，抗原的適應(yīng)性及腫瘤組織微環(huán)境干擾等劣勢。

在實體腫瘤治療研究領(lǐng)域，CAR-T 技術(shù)的運用依舊面臨巨大的挑戰(zhàn)。生理狀態(tài)下，免疫檢查點分子通過負向調(diào)控免疫細胞的活性，達到負向監(jiān)控免疫系統(tǒng)，抑制免疫系統(tǒng)過度激活的目的。但在腫瘤組織中，腫瘤細胞可通過靶向激活免疫檢查點的方式來抑制免疫細胞發(fā)揮作用，抑制活性免疫細胞分泌抑制腫瘤細胞因子和趨化因子等，從而實現(xiàn)免疫逃逸。現(xiàn)階段，通過使用免疫檢查點單克隆抗體抑制腫瘤逃逸或?qū)⑵渑c多種腫瘤治療方式聯(lián)用表現(xiàn)出良好的抑制腫瘤生長的效果。在實體瘤治療領(lǐng)域，理想狀態(tài)下，CAR-T細胞在體內(nèi)應(yīng)準確進入實體瘤，且可有效地進行增殖、活化。在多數(shù)研究中，通過多種形式的免疫檢查點調(diào)控，可增強CAR-T 的功能。但現(xiàn)階段，針對免疫檢查點聯(lián)用CAR-T 治療的研究尚存在不足，因此使用免疫檢查點作為CAR-T 的靶向位點有可能是新的研究方向。除免疫檢查點分子調(diào)節(jié)CAR-T 細胞功能的策略外，隨著更多新型免疫檢查點的發(fā)現(xiàn)，是否可用于CAR-T 的構(gòu)建或T 細胞功能的加強尚需要進一步的驗證。此外，加強CAR-T細胞對實體腫瘤浸潤的策略亦尚需要進一步研究，尋找合適的免疫檢查點調(diào)控、聯(lián)用策略以及探尋準確、高效的腫瘤匹配CAR-T 治療方式在實體腫瘤治療策略的研究中具有重要意義。