河北省野生苔草屬植物ISSR分子標記開發(fā)及親緣關(guān)系分析

周欣瑩,耿宇航,賈艷艷,孫浩男,劉冬云,李 艷

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院,河北 保定 071000)

莎草科(Cyperaceae)苔草屬(Carex)植物種類多,分布極廣,全球約有2 000種,我國約有500種[1-2],其中,河北省內(nèi)約有45種[3]。苔草屬植物種類繁多,適應(yīng)性強,觀賞價值高,能夠作為優(yōu)質(zhì)的草坪地被植物[4]。同時,苔草屬植物在生態(tài)修復(fù)方面也發(fā)揮著重要的作用[5]。在苔草屬的分類中,常常以小穗的單性或兩性以及鱗片、果囊的差異等特征定性,形態(tài)學(xué)鑒定較為困難。要識別特定的苔草,首先確定其亞屬定位,然后是選擇正確的分組[6],因此有必要開發(fā)分子標記來鑒定和區(qū)別苔草屬植物。

目前,用于研究苔草屬植物的分子標記較少。Nagasawa等[7]基于二代轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)了日本北部索爾法塔拉地區(qū)的特有植物C.angustisquama的EST-SSR分子標記,并與其近源種C.doenitzi、C.podogyna進行分析后發(fā)現(xiàn),C.angustisquama的較低多態(tài)性可能是由于種群進化關(guān)系導(dǎo)致。Jiménez-Mejías等[8]提出并討論了ETS、ITS、matK 3種分子標記方法開發(fā)大型系統(tǒng)發(fā)育假說,以及這3種分子標記的使用方法,提出了新定義的系統(tǒng)發(fā)育假說,這也是苔草屬植物的第一個大規(guī)模系統(tǒng)發(fā)育假說。我國學(xué)者常采用ISSR分子標記對苔草屬進行研究,ISSR分子標記技術(shù)有操作簡便、穩(wěn)定性高等優(yōu)點[9]。寧花等[10]建立了山東省苔草屬植物的ISSR最優(yōu)體系,并對28份山東省苔草屬種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析;胡延萍等[11]使用正交優(yōu)化方法建立了黑褐苔草(C.atrofusca)的ISSR-PCR體系,擴增出了清晰穩(wěn)定的條帶。

河北省有著豐富的苔草屬種類,但尚未系統(tǒng)性地調(diào)查收集這些種質(zhì)資源,《河北省植物志》目前所記錄的45種苔草中,大部分僅在花果期才能進行較為有效的區(qū)分和鑒定,極大地影響了其研究和開發(fā)利用。因此,本研究優(yōu)化并建立了適用于河北省野生苔草屬植物分類鑒定的ISSR分子標記體系,進行遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析,旨在從分子角度上為苔草屬分類、鑒定、育種及指紋圖譜等研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包括33種河北省野生苔草(根據(jù)《河北省植物志》及《內(nèi)蒙古植物志》鑒定),采自保定市、霧靈山、小五臺山及承德等地,以及20份國外引種的苔草種質(zhì),共計53份,引種收集后栽植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗基地,并對其表型性狀進行測量和描述,詳見表1。

表1 供試苔草信息Table 1 The information of the tested Carex species

1.2 方法

1.2.1DNA的提取及目標引物的篩選 按照DNA提取試劑盒(CW0531S,康為世紀)說明書步驟提取53份苔草樣本的DNA后,用Nano Drop微量分光光度計進行DNA純度檢測并使用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。將DNA母液稀釋至40 ng·μL-1。利用加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)所公布的100條ISSR通用引物進行試驗,選取中亞苔草和異鱗苔草DNA為模板進行初篩,去除無擴增產(chǎn)物以及彌散嚴重的引物,篩選出擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、條帶清晰且多態(tài)性較好的引物。25 μL PCR反應(yīng)體系：2 μL DNA模板、2 μL引物(6 μmol·L-1)、12 μL Master Mix,用ddH2O補足。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,退火45 s,72℃延伸1 min,38個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。試驗所用引物、Master Mix和2 000 bp DNA marker均購自北京天根生物有限公司。

根據(jù)公式：η=1-(1-1/2)n(n為樣品數(shù),η為有多態(tài)性引物的選中概率),計算選中的有多態(tài)性引物的概率。本研究利用4個DNA樣品進行測試,則有多態(tài)性引物的選中概率為93.75%。

1.2.2ISSR反應(yīng)體系單因素優(yōu)化 以U845為引物,芒髯苔草‘香草冰’的DNA作為模板,對DNA模板含量、引物濃度、Master Mix含量和循環(huán)數(shù)設(shè)定6個梯度,以單因素優(yōu)化法進行4組試驗(表2),如：當進行DNA模板優(yōu)化試驗時,其他3組因素保持不變,使用1.2.1中PCR反應(yīng)體系及程序。

表2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的單因素優(yōu)化Table 2 ISSR-PCR amplification by the single factor experiment

1.2.3ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化 對各因素優(yōu)化篩選后,選擇能擴增出清晰條帶的3個梯度進行正交優(yōu)化,參考董如何等[12]的方法設(shè)計L9(34)正交表(表3)。

表3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化Table 3 Orthogonal design for ISSR-PCR

1.2.4ISSR-PCR正交反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果評價 參照張麗[13]的方法,按照擴增出條帶的數(shù)目、亮度、清晰度及特異性分別對9個組合評分,條帶多、亮、無雜帶拖帶的得分最高,為6分,條帶少、弱、拖帶多的得1分,按照評分結(jié)果計算方差、極差,確定最佳體系與各因素對體系的影響。

1.2.5引物篩選及退火溫度的優(yōu)化 根據(jù)引物的Tm值來確定最優(yōu)退火溫度。以中亞苔草和翼果苔草的DNA為模板,設(shè)定退火溫度為46.4℃,47.6℃,48.8℃,50℃,51.2℃,51.4℃,52.1℃,53.2℃,54.4℃,55.6℃,56.8℃,58.0℃。

1.2.6ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化結(jié)果驗證 隨機挑選U823、U840、U845、U876這4條引物,對隨機選出的寬葉苔草、矮叢苔草、白鱗苔草、早春苔草4份苔草樣本進行擴增。驗證所得到的ISSR-PCR反應(yīng)體系,觀察條帶是否清晰且多態(tài)性高。

1.2.7數(shù)據(jù)分析 按照人工讀帶的原則[10],記下所有在產(chǎn)物同一區(qū)域顯示出來的條帶,將清晰、無拖尾的條帶記為“1”,模糊或無條帶的顯示記為“0”,將統(tǒng)計結(jié)果輸入Excel待分析。使用NTsys軟件,采用UPGMA法繪制聚類圖,使用POPGENE軟件計算有效等位基因數(shù)(Ne)等指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征分析

由表1可知,供試苔草屬植物的小穗分為小穗兩性和小穗單性,小穗兩性即為在同一小穗中存在雌雄同序的情況,包括翼果苔草、尖嘴苔草、卵囊苔草、細葉苔草、中亞苔草、疏穗苔草、棕櫚葉苔草、寬葉苔草、紫鱗苔草、紫喙苔草、華北苔草、白頭山苔草等,其中紫鱗苔草、華北苔草、白頭山苔草均為頂生小穗雌雄順序,其余小穗均為雌性。小穗單性雌雄同株的有毛鞘苔草、早春苔草、披針葉苔草、金穗苔草等。苔草種間的雌雄小穗數(shù)量也有差異,青綠苔草、短鱗苔草、早春苔草、矮叢苔草等的花序大多頂生1個雄小穗,2～4個雌小穗,毛鞘苔草、麻根苔草、糙葉苔草等的花序上部1～3個為雄小穗,下部2～3個雌小穗。小穗形態(tài)有直立和下垂兩種形式,具短柄或無柄的小穗直立,包括青綠苔草、異鱗苔草、紅穗苔草等;小穗柄長且種子數(shù)量大的易下垂,如鴨綠苔草、麻根苔草、扁囊苔草、森林苔草等。

不同種苔草的葉長葉寬不同,毛鞘苔草、鴨綠苔草、糙囊苔草、華北苔草等葉長較長,最長可達80.0～100.0 cm,‘寶藏島’、金穗苔草、扁囊苔草、棕櫚葉苔草等的葉長較短,為30.0 cm以下。寬葉苔草、‘寶藏島’、柄苔草、三裂苔草等的葉寬較寬,最寬可達10.0～25.0 mm,細葉苔草、矮叢苔草、烏蘇里苔草、干生苔草等的葉片較窄,在1.0～2.0 mm之間。

不同種苔草的自然叢高和花序高度也有差異。毛鞘苔草、華北苔草、鴨綠苔草、糙囊苔草等自然叢高可達50.0～80.0 cm,花序高度可達80.0 cm以上,植株較高;早春苔草、披針葉苔草、短鱗苔草、芒髯苔草‘香草冰’等自然叢高30.0～50.0 cm,花序高度20.0～50.0 cm,植株中等;而寬葉苔草、青綠苔草、矮叢苔草、金穗苔草等的自然叢高大多在30.0 cm以下,花序高度在50.0 cm以下,其中矮叢苔草花序較短為8.0～12.0 cm,隱藏于葉叢中。

2.2 DNA模板用量優(yōu)化結(jié)果

模板DNA用量對PCR反應(yīng)影響結(jié)果見圖1。當模板用量過低時,擴增得到的條帶數(shù)較少、顏色較淡。模板DNA處于60～80 ng時,擴增的條帶清晰且明亮。

2.3 目標引物濃度優(yōu)化結(jié)果

不同引物濃度對PCR反應(yīng)影響結(jié)果見圖2。引物濃度為3 μmol·L-1時最暗淡且不清晰,引物濃度在4～6 μmol·L-1之間時,能擴增出較為清楚的條帶。當引物濃度大于6 μmol·L-1時,擴增得到的條帶有拖帶。

圖1 DNA模板用量對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.1 Effects of DNA dosage on ISSR-PCR reaction system注：M：DL 2000 DNA Ladder;1～6 DNA濃度分別為30,40,50,60,70,80 ngNote：M：DL 2000 DNA Ladder;1～6 DNA concentration of 1～6;30,40,50,60,70,80 ng respectively

圖2 引物濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.2 Effects of primers on ISSR-PCR reaction system注：1～6引物濃度分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0 μmol·L-1Note：Primer concentration of 1～6：3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0 μmol·L-1 respectively

2.4 Master Mix體系用量優(yōu)化結(jié)果

Master Mix含量對PCR體系影響結(jié)果見圖3。Mix加入量小于11 μL時,擴增條帶淺且數(shù)量較少。含量在11～14 μL時擴增條帶變多且穩(wěn)定清晰?？紤]節(jié)約成本,11 μL為Mix最佳用量。

2.5 ISSR-PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果

循環(huán)數(shù)對PCR反應(yīng)體系的影響見圖4。28個循環(huán)下無擴增條帶出現(xiàn),33個循環(huán)下條帶顏色淡且模糊,53個循環(huán)下條帶過亮且有拖帶。38,43和48循環(huán)下均有條帶產(chǎn)生,但38和43個循環(huán)擴增出的條帶少,當PCR循環(huán)數(shù)為48時,條帶清晰且穩(wěn)定,故PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)最佳為48個循環(huán)。

圖3 Master Mix用量對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.3 Effects of the Master Mix dosage on ISSR-PCR reaction system注：1～6 Master Mix用量：9.10.11.12.13.14 μLNote：The Master Mix dosage of 1～6：9.10.11.12.13,14 μL

2.6 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

檢測ISSR-PCR正交優(yōu)化擴增產(chǎn)物,見圖5。結(jié)果表明,在9組不同組合中,組合1擴增條帶彌散不清晰;組合2,3,4,9擴增條帶極少且條帶較暗或過亮;組合5,6,7,8擴增條帶清晰且明亮,其中組合8擴增條帶效果最好。3次重復(fù)評分分別為：

(1)1,2,3,3,4,4,4,6,2

(2)1,2,3,3,4,5,4,6,2

(3)1,2,3,4,4,5,5,6,2

用SPSS 22.0對評分結(jié)果進行分析,并計算各因子在4個試驗水平的極差值(T值)和δ值。T值越大表示對ISSR-PCR擴增的影響越大,各因子濃度水平的影響從大到小依次為：模板DNA>循環(huán)數(shù)>Master Mix>引物(表4)。δ值的大小可以確定對應(yīng)因素水平組合。由表4可知δ31>δ21>δ11,δ22>δ31>δ11,δ13>δ33>δ23,δ34>δ24>δ14,因此組合為A3B2C1D3(ABCD表示四個因素,該組合的下標表示該因素所在的水平)得到ISSR-PCR擴增的最優(yōu)結(jié)果。由表5可知,模板DNA、引物、Master Mix、循環(huán)數(shù)對試驗結(jié)果影響顯著(P<0.05)。此時25 μL反應(yīng)體系為模板DNA 80 ng,引物濃度5 μmol·L-1,Master Mix用量11 μL,循環(huán)數(shù)48個。

圖5 ISSR-PCR反應(yīng)的正交優(yōu)化Fig.5 ISSR-PCR amplification by the optimal reaction system

表4 不同試驗因子極差分析表Table 4 Score of different factors

2.7 ISSR引物篩選及多態(tài)性分析

以中亞苔草和翼果苔草的DNA為模板,首先在50℃退火溫度下對100條通用引物進行擴增,初篩出條帶清晰且有多態(tài)性的12條引物,再設(shè)置12個梯度對12條引物進行擴增,部分結(jié)果見圖6。最終篩選的12條引物全部能擴增出清晰明亮且多態(tài)性良好的條帶,詳見表6。

表5 ISSR-PCR正交試驗方差分析Table 5 Optimal results of ISSR-PCR reaction

表6 ISSR引物信息Table 6 Information of 12 ISSR primers

2.8 ISSR-PCR反應(yīng)體系的驗證

隨機挑選4個引物,使用優(yōu)化過的反應(yīng)體系對4份苔草樣本進行擴增,結(jié)果見圖7。不同的引物在不同苔草樣本中均能擴增出清晰、明亮的條帶。因此,本研究所建立的苔草屬ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定、可靠的,適用于后續(xù)苔草屬的ISSR分析。

2.9 親緣關(guān)系分析

2.9.1引物多態(tài)性分析 從100條ISSR通用引物中篩選出12條引物,共擴增出197條清晰條帶,全部為多態(tài)性條帶。每個引物平均擴增出16.4個條帶,多態(tài)性百分比為100%,其中,擴增出來的多態(tài)性條帶最多為引物U807,數(shù)量為22條,擴增出來的多態(tài)性條帶數(shù)最少為引物U868和引物U873,數(shù)量為13條(表7),進一步證實了苔草屬植物變異較廣,且具有豐富的遺傳度。部分擴增結(jié)果見圖8、圖9。

圖7 ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系的驗證Fig.7 Verification of ISSR-PCR optimized reaction system注：1,寬葉苔草;2,矮叢苔草;3,白鱗苔草;4,早春苔草Note：1,C. siderosticta;2,C. callitrichos var.nana;3,C. pisiformis;4,C. subpediformi

表7 12條引物在苔草屬植物中的多態(tài)性分析Table 7 Polymorphism of tested Carex species in 12 ISSR primers

2.9.2親緣關(guān)系分析 使用POPGENE對苔草的有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣性(He)、多樣性信息指數(shù)(I)進行分析,結(jié)果分別為1.153 8,0.125 7,0.236 6。

使用NTsys對人工讀帶的0,1矩陣進行分析,利用非加權(quán)平均法(UPGMA)得到苔草屬的聚類分析圖(圖10),絕大部分材料都能得到良好的劃分,僅長鞭苔草、多刺苔草不能做到有效區(qū)分。在遺傳距離為0.768處,53份苔草屬種質(zhì)可初步被分成6大類,與苔草屬下的分組有一定關(guān)聯(lián)。

第Ⅱ類由糙葉苔草與索蘭德苔草組成,原產(chǎn)于中國和新西蘭,分別屬于苔草亞屬沼生苔草組和苔草亞屬(Carexsubg.Carex),兩種苔草的小穗單性,常具1～4個雄小穗,其余小穗為雌小穗,雌花鱗片棕色,三棱形,但二者在形態(tài)上也有一定區(qū)別,索蘭德苔草的葉寬為0.1～0.2 cm,基部小穗有較長柄,果囊淺棕或深棕色;糙葉苔草的葉寬為0.2～0.4 cm,基部小穗常無柄,果囊淡黃綠色。

圖8 引物U840的部分PCR擴增電泳圖譜Fig.8 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by ISSR primer U840

第Ⅲ類僅有柄苔草一種,屬于苔草亞屬中脹囊苔草組。第Ⅳ類僅有三裂苔草,屬于苔草亞屬(Carexsubg.Carex)。第Ⅴ類由紅穗苔草和矮叢苔草組成,屬于苔草亞屬中沼生苔草組和指狀苔草組,兩種苔草的小穗單性,雌雄同株,果囊較小,果囊無喙或有短喙,喙口部截形或微凹,這兩種苔草的花序高度和形態(tài)不同,紅穗苔草的花序長于葉片,花序上部1～3個為雄小穗,雌花鱗片暗粟色;矮叢苔草花序短于葉片,常隱藏于葉叢中,頂生1個雄小穗,雌花鱗片中間綠色,兩側(cè)栗紫色。第Ⅵ類僅有麻根苔草,屬于苔草亞屬中膜囊苔草。

圖9 引物U876的部分PCR擴增電泳圖譜Fig.9 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by ISSR primer U876

其余46個材料皆屬于第Ⅰ類,同時包括二柱亞屬(Carexsubg.Vignea)、苔草亞屬(Carexsubg.Carex)和二柱苔草亞屬中烈味苔草組和藪苔草組、苔草亞屬中苔草組、寬葉苔草組、溪水苔草組等,二柱亞屬(Carexsubg.Vignea)和苔草亞屬(Carexsubg.Carex)為Villaverde等對苔草屬亞屬進行重新分類得出的新亞屬,二柱亞屬(Carexsubg.Vignea)形態(tài)特征為小穗2至多數(shù),兩性,聚集成穗狀花序,柱頭通常2個,與二柱苔草亞屬的形態(tài)相似,苔草亞屬(Carexsubg.Carex)形態(tài)特征為小穗通常單性,雌雄同株,柱頭3個,與苔草亞屬形態(tài)相似。且原產(chǎn)于不同國家的苔草聚在一起,表明地域性特點不突出。

3 討論

12條引物對53種苔草屬植物材料中共擴增出197個位點,多態(tài)性位點占100%,平均基因遺傳多樣性指數(shù)為0.1257 ,其中,33種河北省野生苔草屬植物的平均遺傳多樣性指數(shù)為0.140 7,雖略低于山東省苔草種質(zhì)[14],但整體上高于目前市面上較為流行的栽培種質(zhì)。33種河北省野生苔草屬植物在引種后發(fā)現(xiàn),絕大部分都具有良好的適應(yīng)性,雖在觀賞特性上遜色于部分園藝品種,但仍有潛力用于后續(xù)開發(fā)成為良好的鄉(xiāng)土植物,并結(jié)合一定育種手段篩選極具觀賞特性的種質(zhì)。

本研究收集了29種《河北省植物志》(1991)包含的苔草種質(zhì),與《河北省植物志》相比新增了4種苔草屬植物,分別是扁囊苔草、干生苔草、灰脈苔草、瘤囊苔草,對于這4份苔草種質(zhì)的鑒定均參考了《內(nèi)蒙古植物志》?；颐}苔草、黃囊苔草等6種苔草為黃金祥等[15]在塞罕壩地區(qū)發(fā)現(xiàn)的新分布。新增材料全部是在河北省承德市塞罕壩北部壩上地區(qū)調(diào)查時發(fā)現(xiàn),該地區(qū)與內(nèi)蒙古交界,壩上屬于內(nèi)蒙古高原的東南緣[16],交界地區(qū)氣候特點相似,具有相同的生境。且灰脈苔草與瘤囊苔草均屬于苔草亞屬中急尖苔草組,在形態(tài)學(xué)分類上關(guān)系較近,僅苞片與果囊不同。干生苔草與黃囊苔草同屬于苔草亞屬中黃囊苔草組,僅果囊形態(tài)與顏色略有不同,在以前的種質(zhì)鑒定中有可能將其誤判。Villaverde等[17]利用轉(zhuǎn)錄組測序?qū)μΣ輰賮唽俚姆诸愡M行檢驗并重新分類,得到六個亞屬分支：(1)寬葉亞屬(Carexsubg.Siderostica);(2)蚤苔草亞屬(Carexsubg.Psyllophorae);(3)尖苞亞屬(Carexsubg.Euthyceras);(4)鉤穗苔亞屬(Carexsubg.Uncinia);(5)二柱亞屬(Carexsubg.Vignea);(6)苔草亞屬(Carexsubg.Carex),《中國植物志》將苔草屬分為二柱苔草亞屬、苔草亞屬和復(fù)序苔草亞屬。我國目前對苔草屬下的分類是依據(jù)形態(tài)學(xué)進行分類,對于全國苔草屬植物分子標記的系統(tǒng)分類還不完整,苔草屬內(nèi)鑒定與分類工作還需進行。

圖10 53種苔草屬植物遺傳距離的ISSR聚類圖Fig.10 ISSR dendrogram of 53 species of Carex

植物的交配方式中很少為單純的自交或異交[18]。苔草屬植物的小穗有兩性和單性的區(qū)別,在兩性小穗中又可分為雄雌順序和雌雄順序,小穗開花時雌花先成熟,雄花花藥散粉后,花粉幾乎全部灑落在雌花柱頭上,這種特征極大的增加了自交的概率[19]。長期的自交或近交會降低種群的遺傳多樣性[20]。在對苔草屬植物進行野外調(diào)查時發(fā)現(xiàn)其生境相似,大多分布在林下、水邊等。其小穗開花數(shù)目多,且花粉粒體積小、質(zhì)量輕、較干燥有利于隨風(fēng)傳播,以風(fēng)作為授粉媒介[21]。苔草屬植物也具有易雜交的特性[22],因此,在同一生境下,花期相遇的近緣種可能會產(chǎn)生自然雜交,導(dǎo)致種間遺傳多樣性降低,日本[23]、烏克蘭[24]、新西蘭[25]等國家均發(fā)現(xiàn)苔草屬植物的天然雜交種。但自然環(huán)境因素、氣候因子、人為因素也是影響遺傳分化的重要因素[26]。

根據(jù)位點分析得到的UPMGA聚類圖可將53份供試材料分為6大類,苔草屬植物分子標記聚類結(jié)果與傳統(tǒng)聚類結(jié)果基本相符,但兩者也存在一定程度的分歧,傳統(tǒng)聚類方式是依據(jù)形態(tài)學(xué)性狀對其分類,形態(tài)學(xué)性狀是由基因與環(huán)境共同調(diào)控的,而分子標記的結(jié)果直接反應(yīng)供試材料基因水平差異[27]。荷蘭引種的‘寶藏島’‘小矮人’與德國引種的多花苔草、索蘭德苔草分別與河北省野生苔草屬材料遺傳距離較近,其原因可能是苔草的遺傳多樣性與原產(chǎn)地分布沒有顯著差異,符合劉凌云等[28]得出地域?qū)μΣ莸倪z傳多樣性沒有顯著差異的規(guī)律。對于一些親緣關(guān)系較近的種質(zhì),很多分子標記難以對其進行區(qū)分,本研究使用的ISSR引物為通用引物,顯示的結(jié)果會存在部分偏差。篩選出的12條引物可以將河北省野生苔草區(qū)分開,但是對于部分國外栽培種質(zhì)區(qū)分不開,其中長鞭苔草與多刺苔草的遺傳距離為1,但是兩者小穗的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完全不同,因此在實際應(yīng)用中需將形態(tài)學(xué)標記與分子標記充分結(jié)合才能對苔草屬的分類進行更加準確的描述或區(qū)分。

4 結(jié)論

本研究首次建立并優(yōu)化了適用于河北省野生苔草屬的ISSR-PCR反應(yīng)體系。25 μL反應(yīng)體系采用模板DNA用量80 ng,引物濃度5 μmol·L-1,Master Mix用量11 μL,循環(huán)數(shù)48個。12條ISSR引物擴增出197條清晰明亮的條帶,全部為多態(tài)性條帶?？捎行^(qū)分33種河北省野生苔草。在遺傳距離為0.768時可將53份苔草種質(zhì)劃分為6類,聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果基本吻合,種間親緣關(guān)系與地理環(huán)境有一定的相關(guān)性。本研究從分子角度上為苔草屬植物的分類鑒定、構(gòu)建指紋圖譜及育種等提供了理論參考。