培養(yǎng)基對蛹蟲草多糖含量及其生物活性的影響

何雯雯 池升春 李衛(wèi)旗 賀 亮*

（1浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058；2浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州310023）

蛹蟲草是擬青霉寄生鱗翅目蛹及其幼蟲后形成的復(fù)合體[1]，含有多糖、蟲草素、腺苷、蟲草酸等多種生物活性成分，具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[4]。蛹蟲草作為冬蟲夏草的同屬真菌，兩者具有相近的化學(xué)成分及生物學(xué)功效，因此可以作為冬蟲夏草的替代品。根據(jù)子實(shí)體形態(tài)，蛹蟲草可分為孢子頭、圓頭、尖頭三種。圓頭形蛹蟲草出草率高、長勢好、不易退化，因此試驗(yàn)用圓頭形蛹蟲草菌株。

目前，我國人工栽培蛹蟲草主要培養(yǎng)基為大米、小麥。筆者以大米、小麥、黃豆、花生、桑蠶、柞蠶、玉米為培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草，研究不同培養(yǎng)基對蛹蟲草多糖生物活性的影響，以期為蛹蟲草定向培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料：圓頭形蛹蟲草菌株（Cm-2 菌株），由浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；大米、小麥、花生、玉米、黃豆、柞蠶、桑蠶，均購于沃爾瑪超市。

試劑、藥品：葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醇、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、苯甲酸、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、L-巖藻糖、D-核糖、三氯乙酸、甲醇、鹽酸羥胺、乙酸酐、二氯甲烷、無水硫酸鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、DPPH·溶液，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：DEAE-陰離子交換柱，英國Watman公司；離子交換層析柱（2 cm×35 cm），美國GE 醫(yī)療集團(tuán)；Sephacryl S-100 HR 層析柱（1.6 cm×60 cm），美國GE 醫(yī)療集團(tuán)；DB-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；U-1900 型可見分光光度計(jì)，日本HITACHI集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲草菌種的固體培養(yǎng)

蛹蟲草菌種經(jīng)液體發(fā)酵3 d 后，過四層紗布，收集濾液待接種。分別制備以大米50 g、小麥50 g、花生50 g、玉米50 g、黃豆50 g 為基礎(chǔ)物的固體培養(yǎng)基。噴霧接種液體菌種2 mL，每種培養(yǎng)基重復(fù)10瓶；選取56 只柞蠶（單重500 g），背部注射液體菌種1.5 mL；選取262只桑蠶（單重500 g），背部注射液體菌種0.5 mL。然后在溫度21 ℃，空氣相對濕度80%，光照200 lx（每天10 h），培養(yǎng)35 d。

1.2.2 蛹蟲草子實(shí)體多糖提取及含量測定

將蛹蟲草子實(shí)體干燥、粉碎，過80 目篩后，用80%乙醇脫脂除去色素。取1 g樣品，按料液比50∶1、微波功率400 W、提取時(shí)間2 h，提取蛹蟲草子實(shí)體粗多糖。制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，苯酚-硫酸法測定多糖含量[5]。

1.2.3 蛹蟲草子實(shí)體多糖的分離純化

將10 mg/mL 多糖樣品溶于蒸餾水，用0.5 mol/L溶液在DEAE-陰離交換柱（2 cm×35 cm）中以1 mL/min 的流速逐漸洗脫樣品。每管收集6 mL 洗脫液，測多糖含量。將10 mg/mL 多糖溶液過S-100凝膠柱純化，該柱用0.05 mol/L 磷酸緩沖液洗脫，流速為0.5 mL/min，即得蛹蟲草子實(shí)體多糖純品。

1.2.4 蛹蟲草子實(shí)體多糖的單糖組成測定

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）分析條件：DB-5MS 石英毛細(xì)管柱、30 mm×0.25 mm×0.25 μm、程序升溫、起始溫度為150 ℃、停留時(shí)間為1 min、以3 ℃/min 升溫至250 ℃、停留5 min、氦氣為載氣、柱流速1 mL/min、分流比10∶1、接口溫度200 ℃、離子源溫度250 ℃、檢測器電壓350 V。

1.2.4.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取100 mg單糖標(biāo)準(zhǔn)品，將其溶于100 mL的50%苯甲酸溶液中，冰箱4 ℃保存。

1.2.4.2 乙?；癎C-MS檢測

樣品加入1 mL 4 mol/L 的三氯乙酸，真空干燥箱120 ℃水解4～6 h。冷卻至室溫，加入甲醇旋干，重復(fù)3 次，除去三氯乙酸。將鹽酸羥胺溶液加入干燥的樣品中，真空烘箱90°C 氧化30 min。冷卻后，加入1 mL 乙酸酐，真空烘箱90 ℃下氧化30 min，加入1 mL 二氯甲烷充分搖動(dòng)，加入無水硫酸鈉振蕩去除水分，過濾膜，待GC-MS檢測。

1.2.5 蛹蟲草子實(shí)體多糖體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 還原力測定

采用普魯士藍(lán)法，VC作陽性對照[6]。

1.2.5.2 ·OH清除率測定

采用水楊酸比色法，VC作陽性對照[7]。

1.2.5.3 DPPH·清除率測定

采用DPPH法，VC作陽性對照[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試固體培養(yǎng)基對蛹蟲草子實(shí)體多糖含量的影響

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.015x+0.0701，R2=0.9941，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體多糖的含量。

圖1 供試培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體多糖含量

由圖1 可見，小麥培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體多糖的含量最高，為5.45%，桑蠶培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體含量最低，僅為0.9%。食藥用菌子實(shí)體及菌絲體的長勢除與培養(yǎng)基自身所含營養(yǎng)成分種類和含量有關(guān)外，還與培養(yǎng)基基質(zhì)顆粒間隙、持水性強(qiáng)弱等因素有關(guān)[9]。黃豆、玉米、花生的持水性較差，滅菌后松散成粒、質(zhì)地堅(jiān)硬[10]；大米、小麥滅菌后變軟，易結(jié)成塊，且大米、小麥含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)及微量元素，經(jīng)菌絲各種酶共同作用降解大分子物質(zhì)，可改善其營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，為蛹蟲草子實(shí)體生長提供充足的碳源、氮源及微量元素等；柞蠶、桑蠶本身含水量及提供的生長空間有限，菌種侵入其體內(nèi)后，需要一定的適應(yīng)時(shí)間，導(dǎo)致子實(shí)體生長速度相對緩慢[11]。

2.2 供試固體培養(yǎng)基對蛹蟲草子實(shí)體多糖的單糖組成影響

根據(jù)DEAE-Sepharose Fast Flow 洗脫曲線收集含量較高的多糖組分，再根據(jù)Sephacryl-S100 洗脫曲線進(jìn)一步分離純化。當(dāng)Sephacryl-S100 洗脫曲線為單一且對稱的峰形時(shí)，則表明分離得到了均一的多糖組分，將該多糖組分濃縮、凍干后即得純品多糖。用Xcalibur 1.2 軟件分析蛹蟲草子實(shí)體多糖的單糖組成，根據(jù)保留時(shí)間確定單糖類型，根據(jù)峰面積確定每種單糖的百分比。如表1 所示，不同類的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草含有不同類型的單糖，花生培養(yǎng)基、大豆培養(yǎng)基的蛹蟲草多糖中單糖種類最多，為6種，桑蠶、柞蠶培養(yǎng)基最少，為3種，供試7種培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草多糖中均檢測到甘露糖、葡萄糖、半乳糖單糖。食藥用菌多糖的合成、分泌過程復(fù)雜，培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵條件、菌株均能影響其單糖組成、比例及生物活性。玉米等7種基質(zhì)本身所含營養(yǎng)成分含量、種類以及酶系不同，可供蛹蟲草子實(shí)體生長的營養(yǎng)物質(zhì)也不同，因此每種基質(zhì)培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體多糖的單糖組成、含量各異。

表1 供試固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草的多糖中單糖組成

2.3 供試固體培養(yǎng)基對蛹蟲草子實(shí)體多糖體外抗氧化活性的影響

2.3.1 對還原力的影響

多糖類物質(zhì)總還原力的高低與物質(zhì)的抗氧化活性呈正相關(guān)[12]。多糖類物質(zhì)能把Fe3+還原成Fe2+，根據(jù)顯色反應(yīng)可初步判斷其還原程度，吸光度值越大表示該物質(zhì)還原力越強(qiáng)[13]。由圖2 可見，大米培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體多糖還原力高于其余6 種培養(yǎng)基，表明其具有良好的抗氧化活性。當(dāng)多糖濃度為12 mg/mL 時(shí)，大米培養(yǎng)蛹蟲草多糖的還原力最高，OD 值為1.64，可達(dá)對照VC 的還原力水平；在此濃度，其他培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草多糖的還原力OD 值分別為 0.99（黃豆）、0.79（柞蠶）、0.87（花生）、1.35（玉米）、1.08（小麥）、0.81（桑蠶）。

圖2 蛹蟲草子實(shí)體多糖還原力

2.3.2 對·OH清除率的影響

水楊酸可以捕獲由Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的·OH，在510 nm 處測定吸光度值，即可計(jì)算多糖對·OH 的清除率。由圖3可見（VC為對照），供試固體培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體多糖對·OH清除率呈劑量效應(yīng)，但差異很小。當(dāng)多糖濃度為12 mg/mL時(shí)，對·OH 清除率最高，分別為（黃豆、柞蠶、花生、玉米、大米、小麥、桑蠶）42.0%、39.7%、35.1%、45.8%、53.7%、37.5%、41.9%。

2.3.3 對DPPH·清除率的影響

圖3 蛹蟲草子實(shí)體多糖對·OH清除率

DPPH·是一種以氮為中心的自由基，溶液呈深紫色。多糖作為一種良好的自由基清除劑，可以與DPPH·結(jié)合，溶液會變?yōu)闇\黃色或無色，可根據(jù)顏色初步判斷清除能力的高低。由圖4 可見，隨著蛹蟲草子實(shí)體多糖濃度的升高，其對DPPH·的清除能力增強(qiáng)。以VC 作陽性對照，當(dāng)多糖濃度為12 mg/mL 時(shí)，大米、玉米培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體多糖對DPPH·清除率較高，分別為81.4%、72.6%，效果明顯；花生、小麥培養(yǎng)的蛹蟲草子實(shí)體多糖對DPPH·清除率較低，分別為50.6%、49.8%。

圖4 蛹蟲草子實(shí)體多糖對DPPH·清除率

2.3.4 差異顯著性分析

方差分析得到組間差異顯著性結(jié)果（表4）。由表4 可見，組間還原力水平的P為0.006，表示組間差異極顯著；對·OH 清除率，組間顯著性分析所得P=0.986>0.05，表明組間差異不顯著，這與上述試驗(yàn)結(jié)果一致；對DPPH·清除率，組間顯著性分析所得P為0.036，表明組間差異顯著。

表4 多糖抗氧化活性差異性分析

3 小結(jié)與討論

蛹蟲草多糖含量是衡量其品質(zhì)的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，7 種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛹蟲草，其子實(shí)體多糖含量及其單糖組成、體外抗氧化活性均不同。其中大米、小麥培養(yǎng)基所產(chǎn)蛹蟲草子實(shí)體多糖含量最高，適合進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。大米、玉米培養(yǎng)基子實(shí)體多糖的單糖組成中，葡萄糖占比較高，抗氧化效果較好。選擇有利于提高蛹蟲草子實(shí)體多糖含量的培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草，可大大降低成本，提高生產(chǎn)效率。此外，培養(yǎng)基所含成分對蛹蟲草活性物質(zhì)合成的作用機(jī)理、對其營養(yǎng)及用途將是今后研究的重要方向。