鄰苯二甲酸酯對(duì)不同發(fā)育階段雄性個(gè)體生殖系統(tǒng)毒性的研究進(jìn)展

袁曉瑞，閔明，柏佳，包淑鈞，程榕，黃曉雪，張繼東

(遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義 563000)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)又被稱為肽酸酯，它不容易揮發(fā)、凝固點(diǎn)較低，一般為無色透明的油狀黏稠液體，難溶于水，但易溶于甲醇、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。PAEs可以增強(qiáng)產(chǎn)品靈活性、 柔韌性和彈性，被廣泛用作增塑劑，但也是新興污染物之一。它與塑料分子的相容性較好，兩者之間通過氫鍵或范德華力連接，卻維持著相對(duì)獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì)，因而也容易脫離塑料進(jìn)入外界環(huán)境中。去高分子量的PAEs，如鄰苯二甲酸二己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二異癸酯( DIDP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)存在于地板、醫(yī)療設(shè)備和食品包裝中。低分子量的PAEs，如鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)存在于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中[1]。PAEs具有致畸、致癌和致突變作用, 它暴露的主要路線有食物、空氣、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品、室內(nèi)灰塵和藥品等[2]。流行病學(xué)研究顯示，PAEs可能會(huì)導(dǎo)致男性不育[3]。由于胎兒和青春期雄性的生殖器官較成年期敏感，因此PAEs對(duì)生殖系統(tǒng)的毒性可能具有年齡依賴性和差異性?，F(xiàn)就PAEs對(duì)各發(fā)育階段雄性個(gè)體生殖系統(tǒng)毒性的研究進(jìn)展綜述如下。

1 PAEs 對(duì)胚胎期及哺乳期雄性個(gè)體生殖系統(tǒng)的毒性

PAEs在胎兒嬰兒中的暴露水平較高。有研究采用高效液相色譜法測(cè)定30名育齡婦女血清中的PAEs，發(fā)現(xiàn)育齡期婦女血清中PAEs暴露水平較高，特別是DMP、DBP，檢出率均超過50%[4]。隨機(jī)選取哈爾濱市區(qū)252 對(duì)孕婦的新生兒臍帶血進(jìn)行PAEs定量分析，結(jié)果臍帶血中 DMP、DEP、DIBP、DBP的檢出率都超過97%，顯示胎兒出生前普遍經(jīng)母體暴露于多種 PAEs中[5]。嬰兒PAEs累積暴露風(fēng)險(xiǎn)普遍高于其乳母。但在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中均只對(duì)某地區(qū)進(jìn)行了研究，第一個(gè)是選擇寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心某日體檢篩查無其他疾病的 30 名育齡(27～43 歲)婦女進(jìn)行了調(diào)查，第二個(gè)是只對(duì)哈爾濱市區(qū)的孕婦做了調(diào)查檢測(cè)，研究具有局限性，其人種、生活環(huán)境、營養(yǎng)狀況等非處理因素不能得到很好的控制，而且無法排除是不是哈爾濱市區(qū)環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了影響。 Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，孕產(chǎn)婦暴露于DBP(妊娠和哺乳期)可導(dǎo)致血清睪酮濃度和附睪精子活力降低，附睪精子濃度也明顯減少。生命早期暴露會(huì)使男性生殖功能在以后的生活受到極大影響，因此，關(guān)于PAEs對(duì)胚胎及哺乳期暴露影響的研究引起了廣泛關(guān)注。

1.1 胚胎期 男性生殖系統(tǒng)從胚胎期就開始發(fā)育，如果在胚胎期就暴露于PAEs，會(huì)影響嬰兒生殖器的正常發(fā)育，造成男嬰生殖系統(tǒng)畸形。有研究顯示，將妊娠期母鼠暴露于30 mg/(kg·d) DEHP，出生后30 d 的雄性仔鼠血液中黃體生成素水平無明顯改變，而睪丸質(zhì)量下降，卵泡刺激素水平也有明顯下降[7]。Ahmad等[8]對(duì)懷孕14 d的大鼠用4、20、100 mg/kg 的BBP灌胃染毒，發(fā)現(xiàn)最高濃度組的 F1雄性大鼠，其附睪和前列腺質(zhì)量下降，精子質(zhì)量變差，血清睪酮水平也相對(duì)降低。

目前研究表明，母體妊娠期暴露于PAEs可引起雄性子代個(gè)體性激素尤其是睪酮水平的異常，進(jìn)而引起睪丸病變及生殖系統(tǒng)畸形，但對(duì)于其代謝產(chǎn)物的毒性研究還有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。胚胎期接觸PAEs，可能會(huì)在不同的發(fā)育階段引發(fā)不同的疾病，即睪丸源性生殖障礙綜合征(TDS)[9]，可見母體妊娠期對(duì)于胎兒的保護(hù)尤為重要和關(guān)鍵。

1.2 哺乳期 DEHP暴露與男嬰出生體質(zhì)量、胎齡呈負(fù)相關(guān)。孕鼠染毒 DEHP 可引起雄性仔鼠尿道下裂，并且尿道下裂的概率、程度與染毒劑量呈正相關(guān)[10]。Dorostghoal 等[11]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)婦在妊娠和哺乳期間接觸DEHP劑量超過100 mg/(kg·d)，會(huì)影響生產(chǎn)的男嬰睪丸的發(fā)育，，使生精小管直徑減小，平均胚上皮高度下降，精子濃度降低。陳涵斌等[12]對(duì)于哺乳期母鼠染毒不同劑量DEHP對(duì)雄性仔鼠影響的研究顯示，低劑量DEHP可能會(huì)促進(jìn)雄性仔鼠性早熟，中高劑量DEHP可引起雄性仔鼠的血清睪酮水平下降，其機(jī)制可能與DEHP抑制仔鼠Leydig細(xì)胞StAR蛋白的表達(dá)和損傷仔鼠Leydig細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有密切關(guān)聯(lián)。雄性哺乳期暴露于PAEs產(chǎn)生的顯著生殖影響為精子產(chǎn)量減少，此外還誘導(dǎo)了睪丸及其他生殖器官的較多病理改變，由此推斷，哺乳期可能是PAEs最易發(fā)生生殖毒性的時(shí)期。

2 PAEs 對(duì)青春期雄性生殖系統(tǒng)的毒性

青春期是性腺發(fā)育、內(nèi)分泌激素合成和代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)男性生育能力的提升起著至關(guān)重要的作用。青春期接觸PAEs可能會(huì)對(duì)各類睪丸細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成直接或間接的傷害，從而引起激素水平的改變，影響男性生殖能力。

2.1 對(duì)睪丸細(xì)胞的影響 有研究結(jié)果表明，青春前期SD大鼠染毒DEHP可損害睪丸組織中的各類細(xì)胞，造成支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、各級(jí)生精細(xì)胞變性，出現(xiàn)不同程度的數(shù)量減少、萎縮及細(xì)胞內(nèi)一些細(xì)胞器的腫脹融合甚至空泡樣改變，說明細(xì)胞合成和分泌蛋白的功能受到了影響，生精細(xì)胞的代謝活動(dòng)異常，這些改變可能是導(dǎo)致精子活力降低、數(shù)量減少的原因之一[13]。

2.2 對(duì)激素分泌的影響 也有研究認(rèn)為，DBP可能會(huì)影響青春期雄性垂體功能，卵泡刺激素對(duì)睪丸支持細(xì)胞功能有調(diào)節(jié)作用，影響精子發(fā)生。卵泡刺激素升高的機(jī)制可能是DBP嚴(yán)重?fù)p壞睪丸支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致支持細(xì)胞數(shù)量的減少和抑制卵泡刺激素的抑制激素分泌減少。睪酮分泌減少，睪丸支持細(xì)胞功能障礙、數(shù)量減少，導(dǎo)致生精細(xì)胞減少，抑制精子生成[14]。黃體生成激素是糖蛋白激素，結(jié)合于受體LHCGR，屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)超家族。黃體生成激素通過控制睪酮生產(chǎn)，調(diào)節(jié)精子發(fā)生作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞[15]。

生殖激素可以調(diào)控睪丸產(chǎn)生精子的過程。卵泡刺激素由垂體分泌，作用于睪丸曲細(xì)精管的上皮支持細(xì)胞,生精上皮出現(xiàn)損傷時(shí)血清卵泡刺激素水平也會(huì)相應(yīng)地出現(xiàn)異常。因此精子產(chǎn)生需要高濃度的雄性激素環(huán)境[16]。睪酮的合成是由下丘腦-垂體-性腺軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)控制，睪酮水平的增加激活下丘腦雌激素受體，抑制垂體分泌黃體生成素。DBP抑制睪丸類固醇激素分泌，引起血清卵泡刺激素和黃體生成素降低，可能是通過作用于下丘腦雄激素受體實(shí)現(xiàn)的。

3 PAEs 對(duì)成年雄性生殖系統(tǒng)的毒性

目前的研究已經(jīng)表明，PAEs生殖毒性作用的重要靶器官是睪丸。成年雄性大鼠暴露在PAEs下可引起睪丸萎縮及內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變，睪丸中支持細(xì)胞、生殖細(xì)胞等發(fā)育異常，影響雄性激素的正常分泌，降低精子質(zhì)量，附睪、前列腺等組織結(jié)構(gòu)也會(huì)受到影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致雄性不孕不育。

3.1 對(duì)睪丸大體結(jié)構(gòu)的影響 成年大鼠暴露于某些高劑量的PAEs后將引起睪丸形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變。 Ha等[17]用DEHP連續(xù)灌胃SD大鼠 30d后，觀察發(fā)現(xiàn)大鼠睪丸內(nèi)生精小管變形、生精細(xì)胞凋亡、睪丸支持細(xì)胞及睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加，DEHP 暴露后通過干擾下丘腦-垂體-睪丸 (HPT) 軸和誘導(dǎo) 5α-還原酶兩項(xiàng)來降低血清睪酮水平。但實(shí)驗(yàn)采用的對(duì)大鼠連續(xù)灌胃的方法，沒有模擬出真實(shí)的大鼠暴露于DEHP的情況，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可靠性。

Lagos-Cabré 等[18]提出DEHP 及其代謝產(chǎn)物 MEHP 在動(dòng)物包括人體中充當(dāng)內(nèi)分泌干擾物 (EDs)，認(rèn)為EDs優(yōu)先攻擊青春期發(fā)育的睪丸而不是成年的睪丸，但由于缺乏相關(guān)分子機(jī)制的研究，以及不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮斐山Y(jié)果，妨礙了他們的進(jìn)一步探索。

3.2 對(duì)睪丸超微結(jié)構(gòu)的影響 PAEs影響大鼠睪丸組織的超微結(jié)構(gòu)。秦逍云等[19]研究顯示，光鏡下病理檢查觀察到中高濃度 DEHP 染毒后，大鼠睪丸支持細(xì)胞內(nèi)形成了大量的空泡，且空泡隨暴露時(shí)間變長(zhǎng)而明顯，生精細(xì)胞脫落減少，睪丸間質(zhì)細(xì)胞異常增生；電鏡下超微檢查發(fā)現(xiàn)，中高劑量DEHP組睪丸細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞核嚴(yán)重變形，細(xì)胞器少，線粒體嵴減少、脫顆粒、鞘異常，精原細(xì)胞內(nèi)可見大量空泡。但是該文獻(xiàn)只研究了DEHP單一物質(zhì)染毒的影響，而事實(shí)上PAEs卻是混合暴露在環(huán)境中的，且以灌胃的方法染毒也與真實(shí)情況有不符之處，所以還需進(jìn)一步合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

3.3 對(duì)激素分泌的影響 目前的研究大多認(rèn)為，PAEs具有類雌激素樣作用和抗雄激素作用，進(jìn)入機(jī)體后會(huì)干擾雄性激素和雌性激素的分泌，對(duì)生殖系統(tǒng)造成明顯的損傷。Ulla等[20]發(fā)現(xiàn)881例健康男性的尿液、血清和精子樣本中DEHP和DINP濃度都與睪酮/黃體生成素的比值呈負(fù)相關(guān)。

Gao等[21]用鄰苯二甲酸酯(MIXPs)灌胃雄性大鼠，結(jié)果大鼠血清睪酮水平降低，病理組織學(xué)檢查顯示睪丸損傷 (可見落葉精子細(xì)胞)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用MIXPs灌胃大鼠15周后，大鼠的睪丸結(jié)構(gòu)遭到損害，血清睪酮、黃體生成素水平降低，可能與類固醇合成蛋白 (StAR、 P450scc、CYP17A1和17β-HSD)以及細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)(p53、Chk1、 Cdc2、CDK6、Bcl-2和 Bax)的調(diào)控有關(guān)[22]。這種PAEs的實(shí)際綜合暴露，相比單一因素的研究，更貼近生活環(huán)境，但對(duì)于分子機(jī)制的研究需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3.4 對(duì)精液和精子的影響 PAEs能對(duì)精子的形態(tài)和結(jié)構(gòu)造成不可逆性的損傷，孫振平等[23]用低、中、高濃度的DBP灌胃雄性大鼠，發(fā)現(xiàn)隨劑量的升高和灌胃時(shí)間的增加，大鼠生殖系統(tǒng)受到的損害逐步加深，其中高劑量組大鼠的睪丸、附睪質(zhì)量及其臟器系數(shù)均明顯降低，精子數(shù)、精子存活率明顯降低，并伴有精子頭體分離的現(xiàn)象，但實(shí)驗(yàn)中灌胃時(shí)間這一變量取得太少，建議多設(shè)計(jì)幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以便對(duì)大鼠各個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的變化有一個(gè)更確切的認(rèn)識(shí)。

研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠喂養(yǎng) DEHP兩周后, 精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的數(shù)量減少，大鼠精子發(fā)生紊亂，發(fā)現(xiàn)可能是DEHP抑制了DNA 復(fù)制和誘導(dǎo)了線粒體凋亡通路，從而推斷出導(dǎo)致呼吸鏈缺陷和ATP 水平的衰減可能是由于破壞SIRT1的活動(dòng)引起的。目前其睪丸毒性的分子機(jī)制還不清楚。

4 PAEs對(duì)雄性生殖系統(tǒng)毒性的拮抗物

有文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)了硒的關(guān)鍵作用，認(rèn)為硒作為一種有效的氧化還原調(diào)節(jié)器，可以緩解PAEs高濃度暴露導(dǎo)致的生殖毒性?？寡趸跃S生素也可以緩解PAEs的生殖毒性。例如，維生素E對(duì)B苯并芘所致的生殖毒性具有拮抗作用。有學(xué)者觀察到被鄰苯二甲酸二丁酯染毒的大鼠在使用益腎生精膠囊治療后，精子畸形率降低，睪丸和附睪結(jié)構(gòu)得到改善，血清黃體生成素水平升高。文獻(xiàn)報(bào)道，枸杞汁是一種預(yù)防以及對(duì)抗PAEs的保健藥品或者功能食品，可以通過增加UGT1活性來促進(jìn)DEHP的代謝及排泄，發(fā)揮解毒效應(yīng)。研究結(jié)果表明，槲皮素對(duì)DEHP誘導(dǎo)的大鼠睪丸毒性有預(yù)防作用。上述相關(guān)研究表明硒、益腎生精膠囊、大豆異黃酮、枸杞汁、抗氧化維生素對(duì)PAEs生殖毒性有拮抗作用，此外，益腎填精中藥合劑對(duì)EEDs具有拮抗作用，原花青素可有效的緩解砷對(duì)雄性小鼠的生殖毒性等為我們找尋PAEs拮抗物提供了更多的思路。

PAEs種類繁多，性質(zhì)復(fù)雜，其對(duì)雄性的生殖毒性是當(dāng)今研究的重點(diǎn)。目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多是選擇單一的暴露方式，而生活中PAEs經(jīng)各種途徑混合暴露于人體，因此有必要研究2種以上PAEs是否有毒性復(fù)合作用。PAEs代謝產(chǎn)生的單酯具有更高的生物活性，還可進(jìn)行PAEs 與其代謝產(chǎn)物毒性效應(yīng)的比較。為避免人與動(dòng)物之間的種屬差異，還需多樣本、大數(shù)據(jù)的流行病學(xué)調(diào)查為臨床治療提供有力依據(jù)。此外，PAEs對(duì)雄性生殖不同發(fā)育階段的影響機(jī)制及相互關(guān)系還有待進(jìn)一步研究，暴露后生物體對(duì)PAEs的清除機(jī)制和運(yùn)用中醫(yī)藥治療可作為今后的一個(gè)重要探討方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Sohn J, Kim S, Koschorreck J, et al. Alteration of sex hormone levels and steroidogenic pathway by several low molecular weight phthalates and their metabolites in male zebrafish (Danio rerio) and/or human adrenal cell (H295R) line[J]. J Hazard Mater, 2016,320(7): 45-54.

[2] Jia LL, Lou XY, Guo Y, et al. Occurrence of phthalate esters inover-the-counter medicines from China and its implications for human exposure[J]. Environ Int, 2017,98(4):137-142.

[3] Wang SY, Wang Y, Xie FQ, et al. Analysis of PAEs in semen of infertile men[J]. Int J Occup Environ Health, 2015, 21(1):40-48.

[4] 李玲,田曉梅,張霞,等.育齡期婦女血清中4種鄰苯二甲酸酯類暴露水平的研究[J].環(huán)境與健康雜志,2011,28(9): 792-794.

[5] 孫卓如,王艷梅,孟琪,等.哈爾濱市新生兒臍帶血中鄰苯二甲酸酯含量及其影響因素[J].中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2016,29(2): 130-133.

[6]Wang XY, Sheng N, Cui RN, et al. Gestational and lactational exposure to di-isobutyl phthalate via diet in maternal mice decreases testosterone levels in male offspring [J]. Chemosphere, 2017,17(2):260-267.

[7] Carbone S, Szwarcfarb B, Ponzo O, et al. Impact of gestational and lactational phthalate exposure on hypothalamic content of amino acid neurotransmitters and FSH secretion in peripubertal male rats[J]. Neurotoxicology, 2010,31(6):747-751．

[8]Ahmad R, Gautam AK, Verma Y, et al. Effects of in utero di-butyl phthalate and butyl benzyl phthalate exposure on offspring development and male reproduction of rat[J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2014,21(4):3156-3165.

[9] Bajkin I, Bjelica A, Icin T, et al. Effects of phthalic acid esters on fetal health[J]. Med Preg, 2014,67(5-6):172-175.

[10] Li M, Qiu L, Zhang Y, et al. Doserelated effect by maternal exposure to di( 2-ethylhexyl) phthalate plasticizer on inducing hypospadiac male rats.[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2013,35(1):55-60．

[11] Dorostghoal M, Moazedi AA, Zardkaf A. Long-term effects of maternal exposure to Di (2-ethylhexyl) Phthalate on sperm and testicular parameters in Wistar rats offspring [J]. Iran J Reprod Med, 2012,10(1):7-14．

[12] 陳涵斌，馬駿，李慧敏，等. 鄰苯二甲酸酯染毒哺乳期母鼠對(duì)雄性仔鼠睪丸 Leydig 細(xì)胞形態(tài)及功能的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2015，31( 2):97-101.

[13] 成神洲，常薇，郭星，等.鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯對(duì)青春前期雄性大鼠的生殖毒性 [J].環(huán)境與健康雜志，2016，33(9):781-783.

[14] Mei A, Man XM, Guo XJ, et al. Effects of di-n-butyl phthalate on male rat reproduction following pubertal exposure[J].Asian J Androl, 2011,13(5):702-709.

[15] Laura Riccetti, Francesco De Pascali, Lisa Gilioli, et al. Human LH and hCG stimulate differently the early signaling pathways but result in equal testosterone synthesis in mouse Leydig cells in vitro[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2017,15(1): 2.

[16]崔艷國,張立新,董麗萍，等.男性低生育人群精漿鋅、酸性磷酸酶及血清性激素水平及意義[J].山東醫(yī)藥, 2010,50(25):85-86.

[17] Ha M, Guan X, Wei L, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate inhibits testosterone level through disturbed hypothalamic-pituitary-testis axis and ERK-mediated 5α-Reductase 2[J]. Sci Total Environ， 2016,563:566-575.

[18] Lagos-Cabré R，Moreno RD. Contribution of environmental pollutants to male infertily: a working model of germ cell apoptosis induced by plasticizers[J]. Biol Res, 2012,22(14):161.

[19] 秦逍云，譚琴，徐新云，等.DEHP對(duì)大鼠睪丸組織病理損害和超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2014,24(22):3228-3231.

[20] Ulla NJ, Hanne F, Martin BJ, et al. Phthalate Excretion Pattern and Testicular Function: A Study of 881 Healthy Danish Men[J]. Environ Health Perspect, 2012,120(4):1397-1403 .

[21]Gao HT, Xu R, Cao WX, et al. Food emulsifier glycerin monostearate increases internal exposure levels of six priority controlled phthalate esters and exacerbates their male reproductive toxicities in rats[J]. PLoS One, 2016,11(8):0161253.

[22] Gao HT, Xu R, Cao WX, et al. Effects of six priority controlled phthalate esters with long-term low-dose integrated exposure on male reproductive toxicity in rats[J]. Food Chem Toxicol, 2017,10(1):94-104.

[23] 孫振平,朱愛民,扆雪濤. 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)大鼠精子生成和質(zhì)量的影響[J]. 中國藥師，2014,17(12): 2019-2021.