木棉高效組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)

摘""要：木棉是木棉科木棉屬落葉喬木植物，是我國南方重要的觀賞植物，是廣州市和攀枝花市的市花，不僅具有較高的觀賞價值，還具有有較高的經(jīng)濟價值、藥用價值和食用價值。木棉傳統(tǒng)的繁殖方式為播種和嫁接繁殖，其種子不易保存、易變質(zhì)從而降低種子萌發(fā)率；而嫁接繁殖成活率更低。因此，本試驗開展木棉組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，以木棉種子為試驗材料，通過開展對木棉種子不同消毒方法試驗，確定最適合木棉種子的消毒方法，獲得無菌種苗；并以無菌種苗為外植體，開展不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、頂芽誘導(dǎo)激素組合、頂芽和叢生芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的篩選及煉苗試驗，探索最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素組合、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及煉苗方法。結(jié)果表明：木棉組織培養(yǎng)最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L；木棉種子最佳消毒方法為A2：75%乙醇消毒1"min→無菌水清洗5次→50%"H2O2溶液消毒4"h→無菌水清洗5次；最佳木棉種子苗頂芽誘導(dǎo)分化幼芽的植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA+NAA的組合；最佳誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)基為C2：MS+6-BA"0.5"mg/L+IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L；最佳生根培養(yǎng)基為E3：1/2"MS+IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L+活性炭0.2"g/L；最佳煉苗基質(zhì)為沙子∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1。通過對木棉種子消毒方法、培養(yǎng)基的篩選、激素組合及煉苗試驗，對木棉組織培養(yǎng)技術(shù)進行優(yōu)化，并建立了高效木棉組織培養(yǎng)技術(shù)體系，為木棉種苗離體保存、優(yōu)良單株擴繁、健康種苗繁育及工廠化育苗提供技術(shù)支持，也可為木棉遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：木棉；組織培養(yǎng)；消毒；誘導(dǎo)；生根中圖分類號：S562""""""文獻標志碼：A

Efficient"Tissue"Culture"and"Propagation"Technology"of"Bombax"ceiba

LIN"Fei1，2，"KANG"Yong1，"MUHAMMAD"Dawood3，"ZHOU"Chenran4，"LI"Yamei1，"GUO"Yuhua1，"YIN"Junmei1，5*

1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Crop"Gene"Re-sources"and"Germplasm"Enhancement"in"Southern"China，"Ministry"of"Agriculture"and"Rual"Affairs"/"The"Engineering"Technology"Re-search"Center"of"Tropical"Ornamental"Plant"Germplasm"Innovation"and"Utilization，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"2."Haikou"Experimental"Station，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China;"3."Department"of"Environmental"Sciences，"Bahauddin"Zakariya"University，"Multan"60800，"Pakistan;"4."Yunnan"Agricultural"University，"Puer，"Yunnan"665000，"China;"5."Sanya"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Sanya，"Hainan"572024，"China

Abstract："Bombax"ceiba"is"a"deciduous"tree"belonging"to"the"Genus"Bombax"in"the"Malvaceae"family."It"holds"significantnbsp;importance"as"an"ornamental"plant"of"economic，"medicinal"and"edible"value"in"southern"China."It"is"the"city"flower"of"Guangzhou"and"Panzhihua."The"traditional"propagation"methods"for"B."ceiba"are"seed"sowing"and"grafting."However，"the"seeds"are"difficult"to"preserve"and"easily"deteriorate，"leading"to"decreased"germination"rates."Grafting"results"in"even"lower"survival"rates."Therefore，"this"experiment"aimed"to"study"the"tissuenbsp;culture"techniques"for"the"rapid"propagation"of"B."ceiba."In"this"study，"B."ceiba"seeds"were"used"as"the"experimental"materials，"and"different"disinfection"methods"were"tested"to"determine"the"most"suitable"method"for"seed"disinfection，"aiming"to"obtain"sterile"seedlings."Using"the"sterile"seedlings"as"the"explants，"various"basic"culture"media，"combinations"of"shoot-inducing"hormones，"induction"and"proliferation"media"for"apical"and"adventitious"buds，"as"well"as"rooting"media，"were"tested"and"optimized."Additionally，"seedling"acclimatization"experiments"were"conducted"to"explore"the"optimal"basic"culture"medium，"hormone"combination，"induction"and"proliferation"medium，"rooting"medium，"and"seedling"acclimatization"methods."The"results"showed"that"the"optimal"basic"culture"medium"for"B."ceiba"tissue"culture"was"MS"medium"supplemented"with"30"g/L"sucrose"and"7.5"g/L"agar."The"best"disinfection"method"for"B."ceiba"seeds"was"75%"ethanol"treatment"for"1"min，"followed"by"five"rinses"with"sterile"water，"4-hour"sterilization"with"a"50%"H2O2"solution"prepared"from"30%"H2O2，"and"another"five"rinses"with"sterile"water."The"optimal"plant"growth"regulators"for"inducing"differentiation"of"apical"buds"into"young"shoots"were"a"combination"of"6-benzylaminopurine"（6-BA）"and"naphthaleneacetic"acid"（NAA）."The"best"induction"and"proliferation"medium"was"MS"medium"supplemented"with"0.5"mg/L"6-BA，"0.5"mg/L"indole-3-butyric"acid"（IBA），"30"g/L"sucrose，"and"7.5"g/L"agar."The"optimal"rooting"medium"was"half-strength"MS"medium"supplemented"with"0.5"mg/L"IBA，"30"g/L"sucrose，"7.5"g/L"agar，"and"0.2"g/L"activated"charcoal."The"recommended"substrate"for"seedling"acclimatization"was"a"mixture"of"sand，"peat"soil，"and"vermiculite"in"a"ratio"of"1∶1∶1."Through"the"optimization"of"seed"disinfection"methods，"culture"media"selection，"hormone"combinations，"and"seedling"acclimatization"experiments，"an"efficient"tissue"culture"system"for"B."ceiba"was"established."This"would"provide"technical"support"for"the"in"vitro"preservation"of"B."ceiba"seedlings，"propagation"of"superior"individuals，"healthy"seedling"breeding，"and"the"industrialized"production"of"seedlings，"and"lay"a"foundation"for"the"genetic"transformation"system"of"B."ceiba.

Keywords："Bombax"ceiba;"tissue"culture;"disinfection;"induction;"rooting

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.008

木棉（Bombax"celibate）又名紅花木棉、英雄樹，為木棉科木棉屬植物[1]，原產(chǎn)中國南部、亞洲熱帶和澳大利亞地區(qū)[2]。木棉樹體高大，樹形優(yōu)美，先花后葉，花朵碩大，花色鮮艷，春季開放，花期較長，具有較高的觀賞價值，是我國南方地區(qū)重要的綠化樹種[3?4]。木棉觀賞價值極高，而且在適宜的環(huán)境條件下生長速度快，是一種難得的生態(tài)林、景觀林和經(jīng)濟林，是園林綠化行道樹的良好樹種，在我國已有2000多年的栽培歷史[5]。

木棉花和種子都具有較高的經(jīng)濟價值，木棉花和樹皮均可入藥，木棉花入藥清熱除濕，樹皮可作為滋補類藥物入藥，木質(zhì)較輕，木材常加工為蒸籠、船上用品、火柴?；蚣垙埖仁褂谩Ｄ久薹N子中含有20%～25%的油分，榨取其中的油分可以制成肥皂，榨油剩余的材料可作為肥料或家畜飼料使用。木棉果實內(nèi)部充滿棉絮，其棉絮可做枕頭、棉被的填充物，同時木棉棉絮也是救生圈的優(yōu)良填充材料[6]。

木棉傳統(tǒng)的繁殖方式是播種和扦插[7]，但由于種子含油量高，易變壞喪失萌發(fā)力，萌發(fā)率低，一般要求采后當年及時播種，扦插成活率低，且播種繁殖不能保持母本的優(yōu)良性狀，木棉組織培養(yǎng)育苗，相對于傳統(tǒng)的種子繁殖或扦插繁殖，組織培養(yǎng)育苗更利于實現(xiàn)木棉的工程化育苗。前人對木棉植物的研究比較少，主要集中在生理生化、木棉種質(zhì)資源調(diào)查與評價方面[8?12]，有關(guān)組培研究方面的報道不多。本研究以木棉種子為材料，無菌種苗為外植體，通過消毒方法、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)激素組合、誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基的篩選及煉苗試驗，建立高效木棉組培快繁技術(shù)體系，為木棉種苗離體保存、優(yōu)良單株擴繁及健康種苗繁育及工廠化育苗提供技術(shù)支持。

1""材料與方法

1.1""材料

本試驗材料所用木棉種子采摘于昌江縣王下鄉(xiāng)木棉樹。

1.2""方法

1.2.1""外植體消毒方法""將飽滿無破損的木棉種子放置于燒杯中，用洗衣粉水浸泡10"min，流水沖洗30"min，置于無菌操作臺用無菌水洗3遍，再用75%乙醇消毒1"min，無菌水沖洗5次，消毒劑選擇30%"H2O2，配成50%溶液浸泡3、4、5h；4%"NaClO溶液浸泡20、40、60"min，最后用無菌水沖洗5次（表1），用H2O2和NaClO不同消毒處理方法進行消毒，最后用無菌水沖洗5次，放在無菌濾紙上吸干種子表面水分，待接種。

以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖MS+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L和B5+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L中，pH"5.9。每個處理接種20瓶，每瓶3粒種子，重復(fù)3次。初始暗培養(yǎng)，露白后進行光照處理，溫度25"℃、光照強度3000"lx條件下培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，接種第3天和第7天觀察并記錄污染率，第7天記錄種子萌發(fā)率，篩選最佳消毒方法。

1.2.2""木棉外植體誘導(dǎo)方法""木棉種子苗接種7"d左右開始露白，15"d長成試驗材料需要的無菌種苗，將木棉無菌種子苗頂芽為誘導(dǎo)材料，接種到添加不同激素的MS培養(yǎng)基中（表2），MS為對照培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種5個外植體，置于25～28"℃條件下暗培養(yǎng)一周，轉(zhuǎn)置LED燈光照10～12"h/d，光照強度1000～1200"lx，25～28"℃條件下培養(yǎng)，25"d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

1.2.3""木棉不定芽增殖方法""切取木棉頂芽誘導(dǎo)的再生芽帶芽莖段，接入到不同增殖培養(yǎng)基中（表3），每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種5個外植體，置于LED照明燈光照10～12"h/d，光照強度1000～1200"lx，溫度25～28"℃；25"d后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4""木棉組織培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選""切取木棉頂芽誘導(dǎo)的不定芽帶芽莖段，接入到不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（表4），每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種5個外植體，置于LED照明燈光照10～12"h/d，光照強度1000～1200"lx，溫度25～28"℃；25"d后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.5""不定芽生根方法""選擇生長一致、健壯的叢生芽苗切取單株接種到不同生根培養(yǎng)基中（表5），每個處理接種10瓶，每瓶接種2株，置于26～28"℃條件下暗培養(yǎng)7"d，再置于LED照明燈光照16"h/d，光照強度1000～1200"lx，溫度26～28"℃條件下培養(yǎng)，30"d后統(tǒng)計生根率。

1.2.6""組培苗煉苗方法""挑選高于3～5"cm、葉色較綠、根系發(fā)達的木棉組培苗，從組織培養(yǎng)室移至實驗室或溫室大棚，瓶內(nèi)煉苗7"d；然后將瓶蓋揭開1/3，放置3"d；最后將瓶口完全揭開放置3"d后，用鑷子將苗輕輕取出，洗凈培養(yǎng)基，將洗好的苗移栽至不同煉苗基質(zhì)種植（表6），移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照時間12"h/d，煉苗過程中，保證基質(zhì)水分充足，每天噴水2～3次。

2""結(jié)果與分析

2.1""不同消毒劑及消毒時間對木棉種子消毒及萌發(fā)的影響

由表7可知，接種第3天對照（CK）污染率達到80%，第7天污染率為100%，未污染萌發(fā)率為0；處理A1第3天污染率為10%，第7天污染率為30%，未污染萌發(fā)率為87%；處理A2第3天污染率為8%，第7天污染率為20%，未污染萌發(fā)率為85%；處理A3第3天污染率為0，第7天污染率為19%，未污染萌發(fā)率為70%；處理A4第3天污染率為75%，第7天污染率為95%，未污染萌發(fā)率為60%；處理A5第3天污染率為60%，第7天污染率為75%，未污染萌發(fā)率為50%；處理A6第3天污染率為60%，第7天污染率為70%，未污染萌發(fā)率為20%；綜合污染率和種子萌發(fā)率最適合作為木棉種子的消毒劑是H2O2，NaClO作為消毒劑不但污染率高，同時也影響種子的萌發(fā)，CK的污染率高達100%，因此，經(jīng)過多種試驗結(jié)果表明，木棉種子消毒最佳方法為A2：75%污水乙醇消毒1"min→無菌水清洗5次→H2O2∶水="1∶1消毒4"h→無菌水清洗5次，第7天污染率為20%，未污染萌發(fā)率為85%。

2.2""不同植物生長調(diào)節(jié)劑對木棉頂芽誘導(dǎo)的影響

由表8可知，培養(yǎng)基B3：MS+6-BA"1.0"mg/L+"IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA+IBA較適合作為木棉種子苗頂芽誘導(dǎo)的激素，分化幼芽3個以上，幼芽生長健壯、長勢好，植株和葉片顏色顯綠（圖1D）；對照MS不分化幼芽（圖1A）；培養(yǎng)基B1：MS+6-BA"1.0"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L中只添加6-BA一種植物生長調(diào)節(jié)劑分化芽少，發(fā)黃，芽短（圖1B）；培養(yǎng)基B2：MS+6-BA"1.0"mg/L+NAA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L中能分化1～3個芽，芽長勢弱（圖1C）；培養(yǎng)基B4：MS+6-BA"1.0"mg/L+IAA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L有愈傷，分化幼芽少，難形成苗（圖1E）；培養(yǎng)基B5：MS+6-BA"1.0"mg/L+2，4-D"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L形成大量愈傷，不分化芽，適合作為誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基（圖1F）。因此，較適合作為木棉種子苗頂芽誘導(dǎo)分化幼芽的植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA+NAA的組合。

2.3""不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA對木棉組培苗增殖的影響

由表9可知，木棉幼芽誘導(dǎo)率隨激素6-BA濃度的增加而提高，增殖系數(shù)也提高，但當濃度過高愈傷增加影響了幼芽的生長，誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)反而下降，最適合木棉幼芽增殖的培養(yǎng)基為C2：MS+6-BA"1.0"mg/L+IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L，誘導(dǎo)率為97%，增殖系數(shù)為5.5。

2.4""不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對木棉幼芽誘導(dǎo)的影響

由表10可知，MS為培養(yǎng)基更適合木棉幼愈傷多阻礙叢生芽形成，叢芽短偏黃芽的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)幼芽數(shù)量多，叢芽健壯、偏綠、葉片展開（圖2A）；木棉幼芽在B5培養(yǎng)基單芽多、2個芽較少，植株高葉片展開，但葉片枯黃容易脫落（圖2B），不適合作為木棉誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.5""不同濃度NAA和IBA對木棉組培苗生根的影響

生根培養(yǎng)基中不長根；在E1：1/2"MS+NAA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L+0.2"g/L活性炭培養(yǎng)基中生根率65%，生根條數(shù)極少，平均條數(shù)0.53條、葉片黃、苗弱不易成活；在E2：1/2"MS+"NAA"1.0"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L+活性炭0.2"g/L中生根率85%，根數(shù)少，平均根數(shù)0.63條，葉片黃、苗弱不易成活；在E3：1/2"MS+IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L+活性炭0.2"g/L培養(yǎng)基中生根率達95%；平均根數(shù)3.15，葉片偏綠、苗健壯；在E4：1/2"MS+IBA"1.0"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L+活性炭0.2"g/L培養(yǎng)基中生根率達85%；平均根數(shù)2.05，葉片偏綠、苗健壯。因此，較適合作為木棉組培苗生根的激素為IBA，生根率高，平均根條數(shù)也多，葉片偏綠，苗健壯；而NAA對木棉組培苗也有根長出，但是極少，且葉片黃苗弱。較合適作為木棉組培苗的生根培養(yǎng)基為E3：1/2"MS+IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L+活性炭0.2"g/L。

2.6""不同基質(zhì)對木棉組培苗煉苗的影響

由表12可知，沙子保水性不好、營養(yǎng)不足，不利于木棉組培苗煉苗；泥炭土濕度較高、易積水、苗易爛根，影響木棉組培苗成活率；蛭石太輕，組培苗飄浮起來、苗不易固定、泡水死亡；基質(zhì)沙子∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1配比煉苗成活率達到87%，保水性好、不易積水、組培苗不爛根、苗健壯。因此，較適合作為木棉組培苗煉苗基質(zhì)為沙子∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1。

3""討論

在討論不同消毒劑及消毒時間對木棉種子消毒及萌發(fā)的影響時，CK采用75%乙醇消毒1"min，用無菌水清洗5次接種到MS培養(yǎng)基中，第7天污染率達到100%，污染率高；采用H2O2作為消毒劑，消毒不同時間第7天污染率為19%～30%，未污染萌發(fā)率為70%～87%；采用NaClO作為消毒劑，消毒不同時間第7天污染率為70%～95%，未污染萌發(fā)率為20%～60%?？芍?，消毒劑H2O2較適合作為木棉種子消毒劑，以H2O2為消毒劑，開展3個不同時間處理試驗，處理A1和A2的污染率差別不大，但是A2消毒方法未污染種子的萌發(fā)率較高，因此，篩選出較適合的消毒方法為A2：75%污水乙醇消毒1"min→無菌水清洗5次→H2O2∶水=1∶1消毒4"h→無菌水清洗5次，第7天污染率為20%，未污染萌發(fā)率為85%。

在篩選適合作為木棉組培基礎(chǔ)培養(yǎng)基的過程中，發(fā)現(xiàn)B5培養(yǎng)基不合適作為木棉組培基礎(chǔ)培養(yǎng)基，B5作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基芽分化少，芽弱，頂端發(fā)黃死亡；MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基木棉分化幼芽多、健壯偏綠，因此，MS適合作為木棉組培基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

在篩選適合木棉幼芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基激素的過程中，綜合彭洪杏等[13]和劉娟旭等[14]的研究成果，制定不同的激素及濃度相結(jié)合的培養(yǎng)基，篩選出較適合作為木棉幼芽分化和增殖的激素是6-BA和IBA相結(jié)合，較合適的培養(yǎng)基為C2：MS+6-BA"1.0"mg/L+IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L，誘導(dǎo)率97%，增殖系數(shù)5.5。

組培苗生根是植物組織培養(yǎng)技術(shù)的重要環(huán)節(jié)之一，是決定植物組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵因素，也是植物組培快繁體系中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]，特別是木本植物，組培苗的生根難度大，根容易膨化，影響根的形成。本試驗以1/2"MS為生根基礎(chǔ)培養(yǎng)基，開展NAA和IBA兩種激素不同濃度的4種生根培養(yǎng)基，結(jié)果可知，E3：1/2"MS+IBA"0.5"mg/L+蔗糖30"g/L+卡拉膠7.5"g/L+活性炭0.2"g/L較合適作為木棉組培苗生根培養(yǎng)基，但是木棉組培苗的生根數(shù)量并不多，生根率可達到95%，但是平均根數(shù)量3.15，在今后的實驗過程中可以考慮添加椰子水、香蕉等附加物結(jié)合IBA設(shè)置更多處理組，更加細化不同組合培養(yǎng)基對木棉組培苗生根的影響。

生根苗煉苗后開展不同基質(zhì)及配比對組培苗煉苗成活率的影響，由于木棉組培苗生根數(shù)量不多，有可能影響了煉苗的成活率，成活率最高只達到87%，較佳的煉苗基質(zhì)配比為沙子∶泥炭土∶蛭石=1∶1∶1，成活率為87%。

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