貝萊斯芽孢桿菌N46對苦瓜白粉病的防治機(jī)理研究

摘" 要：為探究貝萊斯芽孢桿菌N46對苦瓜白粉病的防治機(jī)理，以前期分離得到的貝萊斯芽孢桿菌N46處理盆栽苦瓜，通過檢測白粉病病原菌Podosphaera xanthii的孢子萌發(fā)率、葉片防御酶活性的變化、活性氧積累、細(xì)胞過敏性壞死、木質(zhì)素積累、抗病相關(guān)基因表達(dá)量的變化以及抗病表現(xiàn)的依賴途徑，開展N46的防治機(jī)理研究。結(jié)果表明：高濃度（6× 108 CFU/mL）的貝萊斯芽孢桿菌N46對苦瓜白粉病的防治效果達(dá)到59.05%；N46處理的苦瓜在病原菌侵染時(shí)其防御酶過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化幅度和峰值出現(xiàn)了大幅增加，活性氧（ROS）積累顯著增加，過敏性壞死率顯著提高，顯著增強(qiáng)了細(xì)胞壁的木質(zhì)素積累率，同時(shí)觀察到N46對葉面白粉病病原菌孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用。本研究檢測了經(jīng)N46處理的苦瓜的抗病相關(guān)基因：茉莉酸（jasmonic acid， JA）反應(yīng)性標(biāo)記脂氧合酶基因（LOC111018837）、水楊酸（salicylic acid， SA）反應(yīng)性標(biāo)記基因（LOC111017362）、與過敏反應(yīng)和細(xì)胞壁強(qiáng)化相關(guān)的過氧化物酶基因（LOC111021192）表達(dá)量的變化，與對照相比，這些基因在苦瓜被白粉病菌侵染時(shí)表達(dá)量顯著增加，其中處理組的JA反應(yīng)性標(biāo)記基因在未接觸病原菌時(shí)也高于對照組的表達(dá)水平。說明N46處理的苦瓜在未接觸病原菌時(shí)即保持了一定水平的抗性基因的“預(yù)啟動”，而在病原菌侵染時(shí)才出現(xiàn)更高的表達(dá)水平。通過布洛芬（IBU）抑制植株的JA反應(yīng)途徑，使貝萊斯芽孢桿菌N46對于苦瓜白粉病的防效幾乎消失，表明N46誘導(dǎo)的苦瓜白粉病抗性的產(chǎn)生依賴于JA途徑。綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌N46通過抑制葉面白粉病菌孢子萌發(fā)和誘導(dǎo)苦瓜產(chǎn)生依賴于JA途徑的抗病性起到對苦瓜白粉病的良好防治效果。本研究為苦瓜白粉病的生物防治提供了新方法，為貝萊斯芽孢桿菌對苦瓜白粉病的防治作用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌；苦瓜白粉??；防治機(jī)理；誘導(dǎo)抗性

中圖分類號：S476.1；S436.429" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Control Mechanism of Bacillus velezensis N46 Against Powdery Mildew of Bitter Melon

XIANG Jiayin1， SHANG Sang1，2*， TIAN Libo2*

1. School of Life and Health Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Sanya Research Institute， Hainan University， Sanya， Hainan 572000， China

Abstract： Potted bitter melon was treated with Bacillus velezensis N46 to explore the mechanism of preventing powdery mildew of bitter melon. The prevention mechanism of N46 was studied by detecting the spore germination rate of powdery mildew pathogen （Podosphaera xanthii）， changes in leaf defense enzyme activity， accumulation of reactive oxygen species， cell allergic necrosis， lignin accumulation， changes in the expression of disease-resistance related genes and disease-resistance pathways. The control effect of high concentration （6×108 CFU/mL） of B. velezensis N46 on powdery mildew of bitter melon reached 59.05%. In the N46 treatment group， the range and peak value of the activity of defense enzymes POD， CAT and SOD increased significantly， the accumulation of reactive oxygen species （ROS） increased significantly， the rate of anaphylactic necrosis increased significantly， and the rate of lignin accumulation in cell wall was significantly enhanced. N46 had a significant inhibitory effect on the conidial germination of pathogen powdery mildew. The expression levels of JA reactive marker lipoxygenase gene （LOC111018837）， SA reactive marker gene （LOC111017362） and peroxidase gene （LOC111021192） associated with allergic reaction and cell wall strengthening were detected in the N46 treated bitter melon. Compared with the control group， the expression levels of the genes increased significantly when bitter melon was infected with the powdery mildew bacteria， and the expression levels of JA reactive marker genes in the treatment group were also higher than those in the control group when there was no contact with pathogenic bacteria. The results indicated that N46 treated bitter melon maintained a certain level of “preactivation” of resistance genes when it was not exposed to pathogenic bacteria， but showed a higher expression level when it was exposed to pathogenic bacteria. Finally， the JA response pathway was inhibited by ibuprofen （IBU）， and the control effect of B. velesiensis N46 on powdery mildew of bitter melon was almost disappeared， suggesting that the generation of N46 induced powdery mildew resistance of bitter melon depended on JA pathway. In conclusion， B. velezensis N46 has a good control effect on powdery mildew of bitter melon by inhibiting the conidium germination of megalomycesfoliata and inducing JA pathway dependent resistance of bitter melon. This study would provide a new method for the biological control of powdery mildew of bitter melon and a theoretical basis for the effect of B. velezensis on the control of powdery mildew of bitter melon.

Keywords： Bacillus velezensis; powdery mildew of bitter melon; control mechanism; induced systemic resistance

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.021

苦瓜（Momordica charantia L.）作為一年生的葫蘆科苦瓜屬的蔬菜作物，廣泛種植于亞洲和非洲的熱帶及溫帶地區(qū)[1]，在我國尤其是南方地區(qū)廣泛栽培[2]，且栽培面積逐年上升。研究表明苦瓜含有高生物活性物質(zhì)，具有良好的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值[3]和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

白粉病作為苦瓜生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重影響苦瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，是苦瓜生產(chǎn)中亟待解決的重要問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)葫蘆科白粉病的發(fā)病率在春秋兩季高達(dá)90%，嚴(yán)重時(shí)可造成達(dá)40%的減產(chǎn)[4]。單囊殼屬（Sphaero th e ca）的瓜類白粉病菌（Podosphaera xanthii）主要為害瓜類葉片，是苦瓜白粉病的最主要病原菌，白粉病菌的感染可引起葉片光合作用的降低，嚴(yán)重時(shí)會引起植株衰弱直至死亡。

目前對于白粉病的防治，仍以抗性品種的選育和使用農(nóng)用化學(xué)殺菌劑為主。白粉病病原菌作為真核微生物有著較強(qiáng)的變異能力和適應(yīng)性，降低了抗病品種選育的實(shí)用度[5]，選育的抗病品種可能再次受到變異病原菌的侵害。而殺菌劑在面對有耐藥性的白粉菌變異種時(shí)防治效果較低，過量使用農(nóng)藥還導(dǎo)致環(huán)境污染和嚴(yán)重的食品安全問題。目前對環(huán)境友好、有良好可持續(xù)性、安全性的生物防治逐漸成為防治白粉病的新趨勢[6]。

大量研究表明，植物伴生細(xì)菌或者土壤中的植物有益細(xì)菌可以作為調(diào)控植物根際土壤微環(huán)境[7]和促進(jìn)植物健康生長[8]的試劑來使用。其中芽孢桿菌屬（Bacillus）的眾多微生物被發(fā)現(xiàn)具有生物防治潛力。芽孢桿菌屬的生防菌主要通過直接抑制和間接抑制[9]來控制植物病害。直接抑制主要是分泌對病原菌具有直接殺傷的代謝物質(zhì)，但這些代謝物會在土壤中擴(kuò)散，有較高的自然環(huán)境毒理風(fēng)險(xiǎn)，需要嚴(yán)格的風(fēng)險(xiǎn)評估。并且這些代謝物在抗擊病原菌的區(qū)域濃度和持續(xù)時(shí)間上都是難以量化和控制的問題[10]。而間接抑制主要是刺激植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性（induced systemic resistance， ISR），另一種是由病原菌攻擊引起的抗病性稱為系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance， SAR）。植物的抗病反應(yīng)涉及植物活性氧積累、植物抗毒素的產(chǎn)生、酚類化合物和病程相關(guān)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，還會在物理層面增加防御，比如植物細(xì)胞壁和角質(zhì)層的加厚[11]，這些增加抗性的生命活動均依賴于植物能量的消耗，SAR持續(xù)性的抗性維持導(dǎo)致高昂的能量成本。與SAR的抗性反應(yīng)不同，ISR在非感染時(shí)期的預(yù)啟動狀態(tài)則允許植物在遭遇病原菌時(shí)以更快的速度更強(qiáng)地作出抗性反應(yīng)，這將顯著降低植物體的能源成本。通過微生物本身或釋放的信號化合物誘導(dǎo)植物對病原體的抗性不會對病原菌有選擇壓力，這些微生物釋放的信號化合物不直接與病原體相互作用，因此，不太可能導(dǎo)致病原菌對防治方式產(chǎn)生抵抗力[12]，且以對植物抗性誘導(dǎo)為主要防治作用方式的微生物一般只考慮對人與動物的致病性，不需要考慮生態(tài)毒理的風(fēng)險(xiǎn)性，具有極好的應(yīng)用前景。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽性好氧細(xì)菌，于2005年被首次報(bào)道和命名。據(jù)研究，貝萊斯芽孢桿菌對于植物致病細(xì)菌有良好的防治效果，已報(bào)道的包括防治番茄青枯病[13]、治療水稻白葉枯病[14]，對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表現(xiàn)出良好的抑制作用[15]?？拐婢矫嬉灿休^好效果，對番茄早疫病菌（Alternaria solani）具有良好的抑制效果[16]。研究還發(fā)現(xiàn)使用貝萊斯芽孢桿菌處理植物有明顯的促生作用[17]，對番茄植株的株高、莖粗、根系生長等生長參數(shù)均有顯著提升[18]，且貝萊斯芽孢桿菌處理土壤中植物有益微生物的豐度和種類均有提升[19]。貝萊斯芽孢桿菌大多能引起植物產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，但需要達(dá)到一定濃度，且一般在根部較易誘導(dǎo)植物抗性，而在葉面的誘導(dǎo)能力因不同菌株而異[20]。貝萊斯芽孢桿菌分布范圍極廣，繁殖速度快，極易存活，具有較高的生物安全性[21]，有著優(yōu)良的生物防治應(yīng)用前景。

前人對于芽孢桿菌屬微生物用于生物防治已有大量研究報(bào)道，但尚無利用貝萊斯芽孢桿菌防治苦瓜白粉病并明確其防治機(jī)理的研究。本研究通過實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的1株編號為N46的貝萊斯芽孢桿菌來探究其對苦瓜白粉病的防治效果。進(jìn)一步通過檢測病原菌孢子萌發(fā)率、苦瓜葉片防御酶活性變化、活性氧積累、細(xì)胞過敏性壞死、木質(zhì)素積累、抗病相關(guān)基因的表達(dá)量變化和探究抗性反應(yīng)作用途徑來揭示拮抗菌對苦瓜白粉病的防治機(jī)理。為苦瓜生產(chǎn)中白粉病的防治提供新的方法，對于苦瓜生產(chǎn)具有十分重要的意義。

1" 材料與方法

1.1" 材料

貝萊斯芽孢桿菌N46：由本實(shí)驗(yàn)室篩選、編號、鑒定并保存。

病原菌：苦瓜白粉病病原菌（Podosphaera xanthii）由本實(shí)驗(yàn)室分離、純化并保存。

植物材料：苦瓜純合品系25-15，由本實(shí)驗(yàn)室保存、提供。

1.2" 方法

1.2.1" 貝萊斯芽孢桿菌N46培養(yǎng)條件" 培養(yǎng)基配比為牛肉膏0.93%、酵母提取物0.52%、氯化鈉0.50%，環(huán)境條件：搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，裝液量為35%，接種量為5%，初始pH為6，培養(yǎng)溫度為32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

1.2.2" 貝萊斯芽孢桿菌N46菌懸液制備" 以1.2.1培養(yǎng)條件對N46進(jìn)行培養(yǎng)。對所得發(fā)酵液常溫4000 r/min離心10 min，棄上清液，以無菌水重懸，測定菌懸液的活菌濃度，并稀釋至6×108、6×107、6×106 CFU/mL，置于4 ℃保存，備用。

1.2.3" N46對苦瓜白粉病的防治效果測定" （1）苦瓜苗處理。取苦瓜純合品系25-15的種子，種子表面使用75%乙醇浸泡消毒3 min，去除殘余乙醇，置于55 ℃水浴20 min后取出，30 ℃浸種24 h后催芽，環(huán)境溫度為30 ℃。待苦瓜長至7日齡，選取長勢一致的苦瓜苗，對葉面及根部噴施N46菌懸液共10 mL，每2 d噴施1次，共施用3次。試驗(yàn)設(shè)置3個N46菌懸液處理：6×108 CFU/mL （T1）；6×107 CFU/mL（T2）；6×106 CFU/mL（T3）。以施用無菌水為陰性對照組（CK?），施用250 mg/L三唑酮溶液為陽性對照組（CK+）。每個處理組10株苗，重復(fù)3次。

（2）白粉病病原菌接種。待上述處理的苦瓜葉片晾干后，用0.05% Tween-20溶液配制成濃度為1×106個/mL的新鮮白粉病菌孢子懸浮液，并均勻噴施在苦瓜苗葉片上完成病原菌接種。

（3）苦瓜葉片白粉病病情分級標(biāo)準(zhǔn)及相對防治率計(jì)算。接種病原菌10 d后，統(tǒng)計(jì)各處理組中所有植株的第1、2片真葉，參考GB/T 17980.30— 2000《農(nóng)藥" 田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）殺菌劑防治黃瓜白粉病》的分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

相對防治效果計(jì)算公式如下：

1.2.4" N46對苦瓜白粉病的防治機(jī)理研究" （1）苦瓜防御酶活性測定。將待測苦瓜分為4個處理組：僅噴施無菌水的健康對照組（CK）；噴施6× 108 CFU/mL N46菌懸液的實(shí)驗(yàn)組（N46）；N46菌懸液處理后再接種病原菌的實(shí)驗(yàn)組（N46+病原菌）；噴施等量無菌水后再接種病原菌的陽性對照組（病原菌）。對這些處理組在接種白粉病病原菌孢子后的0、24、48、72、96 h分別取樣，每個處理組5株苗，重復(fù)3次。參考汪茜等[22]的方法對苦瓜葉片的過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性進(jìn)行測定。

（2）苦瓜葉片活性氧（ROS）積累測定。對 N46處理組和CK噴施接種白粉病病原菌孢子懸浮液，接種24、48、72、96 h后分別隨機(jī)取3株苦瓜的同一葉位的3片葉子，采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法進(jìn)行活性氧積累的檢測。葉片以DAB染色后80 ℃下無水乙醇脫色10 min，觀察記錄葉片出現(xiàn)的紅褐色區(qū)域，以葉片出現(xiàn)紅褐色區(qū)域占葉片總面積的百分比作為該葉片活性氧積累率。計(jì)算公式如下：

（3）白粉病菌孢子萌發(fā)率及苦瓜葉片細(xì)胞過敏性壞死測定。以臺盼藍(lán)（TPB）染色觀察和統(tǒng)計(jì)苦瓜葉片上白粉病菌孢子的萌發(fā)率和葉片細(xì)胞過敏性壞死的情況。對N46處理組和CK噴施接種白粉病菌孢子懸浮液，接種0、24、48、72、96 h后分別取樣，葉片以TPB染色后于80 ℃下無水乙醇脫色10 min，取出葉片用顯微鏡觀察。排除0 h時(shí)已萌發(fā)的孢子后再統(tǒng)計(jì)接種24 h時(shí)的葉面孢子萌發(fā)數(shù)，每個處理組隨機(jī)取5株苦瓜的同一葉位的2片葉子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每組葉片統(tǒng)計(jì)500個孢子，計(jì)算白粉病菌孢子在24 h的孢子萌發(fā)率。每片葉片隨機(jī)統(tǒng)計(jì)30個互作點(diǎn)，以互作點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)色區(qū)域數(shù)占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的百分比作為該葉片細(xì)胞過敏性壞死率。計(jì)算公式如下：

（4）苦瓜葉片木質(zhì)素沉積測定。用甲苯胺藍(lán)染料對脫色后的苦瓜葉片進(jìn)行染色，觀察拮抗菌對植物與病原菌互作點(diǎn)處的木質(zhì)素沉積情況。對N46處理組和CK噴施接種白粉病菌孢子懸浮液，接種24、48、72、96 h后分別隨機(jī)取3株苦瓜的3片葉子，樣品葉片以無水乙醇脫色后，置于1%甲苯胺藍(lán)染料至沒過葉片，避光浸泡12 h，用蒸餾水漂洗去染料后使用顯微鏡觀察植物與病原菌互作點(diǎn)的情況，每片葉片隨機(jī)統(tǒng)計(jì)30個互作點(diǎn)，以互作點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)紫色區(qū)域數(shù)占統(tǒng)計(jì)總數(shù)的百分比作為該葉片病理互作點(diǎn)木質(zhì)素積累率。計(jì)算公式如下：

（5）苦瓜抗病調(diào)控基因表達(dá)的測定。對N46處理組和CK噴施接種白粉病菌孢子懸浮液，接種0、24、48、72、96 h后分別取3株苦瓜第1、2片真葉作為提取RNA樣品。提取RNA后使用NOVA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的苦瓜葉樣品cDNA為模板，以肌動蛋白基因（actin-7-like，LOC1110 216 66）為內(nèi)參基因，參考GARCíA-GUTIéRREZ等[23]在葫蘆科植物甜瓜中檢測的植物抗病有關(guān)的標(biāo)記性基因，在NCBI中進(jìn)行氨基酸序列比對以獲得苦瓜的同源基因，對其進(jìn)行qRT-PCR檢測，試驗(yàn)所用引物見表2。使用qPCR儀（Appliedbio syste ms，賽默飛）進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)，樣品qPCR所用試劑盒MonAmpChemoHS qPCR Mix由Monad公司提供。每個處理3次生物學(xué)重復(fù)。使用相對定量計(jì)算法對儀器測得的Ct值采用2?ΔΔCT法計(jì)算。

（6）阻斷茉莉酸（JA）途徑對N46誘導(dǎo)苦瓜抗病性的影響。布洛芬（IBU）作為JA合成抑制劑可以阻斷JA途徑介導(dǎo)的抗病反應(yīng)，可作為探究N46對苦瓜抗病性的誘導(dǎo)途徑。在接種病原菌前24 h以5 mmol/L IBU溶液涂于苦瓜第1、2片真葉?？喙厦绲念A(yù)處理同1.2.3-（1）。設(shè)置4種處理：無菌水處理后再接種病原菌（A1）；無菌水處理后涂抹IBU，再接種病原菌（A2）；N46菌懸液處理后再接種病原菌（A3）；N46菌懸液處理后涂抹IBU，再接種病原菌（A4）。14 h光照10 h黑暗循環(huán)處理，培養(yǎng)10 d葉片發(fā)病后觀察記錄接種病原菌葉片的病葉級數(shù)，并計(jì)算植株病情指數(shù)。每個處理10株苗，每組重復(fù)3次。

1.3" 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2013軟件對

試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析和制作圖表；采用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 貝萊斯芽孢桿菌N46對苦瓜白粉病的防治效果

由圖1、圖2可以看出，隨著貝萊斯芽孢桿菌N46活菌濃度的增加，對苦瓜白粉病菌的防治效果逐步提升。接種白粉病菌10 d時(shí)，CK-對白粉病的防治效果為0%，三唑酮處理（CK+）的相對防治效果為57.43%，T1、T2、T3處理對苦瓜白粉病的相對防治效果分別為59.05%、33.65%、15.24%。表明T1處理對苦瓜白粉病有較好的相對防治效果，與市售真菌殺菌劑三唑酮的防治效果無顯著差異。

不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05）。

2.2" 貝萊斯芽孢桿菌N46對苦瓜白粉病的防治機(jī)理

2.2.1" N46處理對苦瓜防御酶活性的影響" 由圖3可知，與未接種病原菌處理相比，接種病原菌的2個處理的POD活性在接種48、72、96 h出現(xiàn)大幅提高且差異顯著（Plt;0.05）。其中N46+病原菌處理的POD活性的變化幅度和活性峰值均顯著高于僅接種病原菌處理組，在接種72 h達(dá)到峰值153.35 U/g，比僅接種病原菌處理組高41.50%，并且與僅接種病原菌處理組差異顯著（Plt;0.05）。

由圖4可知，與未接種病原菌處理相比，接種病原菌的2個處理的CAT活性在接種48、72、96 h出現(xiàn)大幅提高且差異顯著（Plt;0.05）。N46+病原菌處理在48 h出現(xiàn)CAT活性顯著增高，酶活性峰值比僅接種病原菌處理提高了約57.00%，不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05）。

由圖5可知，僅接種病原菌的處理在48 h時(shí)出現(xiàn)SOD活性增加，與CK差異顯著（Plt; 0.05），但酶活性增幅較小，且在96 h出現(xiàn)酶活性下降；N46+病原菌處理的SOD活性在48 h出現(xiàn)顯著增高（Plt;0.05），于72 h達(dá)到峰值，比僅接種病原菌處理提高了約53.00%，且96 h時(shí)酶活性下降不明顯。

2.2.2" N46處理對苦瓜活性氧積累的影響" 由圖6可知，N46處理和CK的活性氧積累均隨接種時(shí)間的延長而增加，接種24 h時(shí)活性氧積累率分別為4.30%和2.50%，48 h起產(chǎn)生了較高的活性氧積累，CK在接種48、72、96 h的活性氧積累率分別為15.60%、25.60%、27.80%，N46處理的活性氧積累率在接種48、72、96 h分別為27.80%、41.10%、45.10%，與CK均有顯著差異（Plt;0.05）。

2.2.3" N46處理對白粉菌分生孢子萌發(fā)及苦瓜葉片細(xì)胞過敏性壞死的影響" 通過TPB染色觀察和統(tǒng)計(jì)苦瓜葉片上白粉菌分生孢子的萌發(fā)率和葉片細(xì)胞過敏性壞死的情況。結(jié)果表明，接種24 h時(shí)，CK葉面孢子萌發(fā)率為30.67%，與N46處理的孢子萌發(fā)率（18.80%）差異顯著（Plt;0.05）。

由圖7、圖8可知，各處理的葉片細(xì)胞過敏性壞死率均隨接種時(shí)間的延長而增加。接種24 h時(shí)，CK和N46處理的葉片細(xì)胞過敏性壞死率均較低，在3.00%以下；接種48 h時(shí)，CK和N46處理分別為11.00%和22.00%，二者差異顯著（Plt;0.05）。接種72 h時(shí)，N46處理的過敏性壞死率達(dá)到峰值30.00%，且在96 h時(shí)無明顯下降。而CK在接種48、72、96 h的壞死率均無顯著差異，最高僅14.00%，而與N46處理差異顯著（Plt;0.05）。

2.2.4" N46處理對苦瓜木質(zhì)素沉積的影響" 以甲苯胺藍(lán)對脫色苦瓜葉片進(jìn)行染色，觀察病原菌與植物互作處的木質(zhì)素積累情況。結(jié)果表明，接種24 h時(shí)，N46處理和CK均未觀察到因木質(zhì)素積累而被染色的區(qū)域；接種48～96 h，N46處理和CK的木質(zhì)素積累率均逐漸升高，CK的木質(zhì)素積累率分別為5.70%、12.30%、14.60%，而接種48 h時(shí)，N46處理組的木質(zhì)素積累率即有35.70%，72 h時(shí)達(dá)到68.70%，96 h時(shí)達(dá)到最高值92.60%。各時(shí)期N46處理和CK的木質(zhì)素積累率均有顯著差異（Plt;0.05），且與CK相比，N46處理木質(zhì)素積累染色顯示區(qū)域更大、染色程度更深，表明其在互作點(diǎn)的木質(zhì)素積累量更大（圖9，圖10）。

2.2.5" N46對苦瓜抗病調(diào)控基因的影響" 利用qRT-PCR技術(shù)對苦瓜調(diào)控抗病關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，未接觸病原菌的0 h時(shí)，N46處理的JA反應(yīng)應(yīng)答的標(biāo)記性基因（LOC1110

18837， linoleate 9S-lipoxygenase 6-like）的表達(dá)量約為CK的4.7倍，二者差異顯著（Plt;0.05）；接種病原菌24 h時(shí)，N46處理的表達(dá)量達(dá)到峰值，為CK的2.7倍，之后隨接種時(shí)間的延長N46處理的表達(dá)水平逐漸下降；各時(shí)期CK的表達(dá)量均低于N46處理組，二者均差異顯著（Plt;0.05，圖11A）。

由圖11B可知，接種48 h時(shí)，N46處理的SA反應(yīng)應(yīng)答的標(biāo)記性基因（LOC111017362， pathogenesis-related protein PR-1 type-like）的表達(dá)水平出現(xiàn)大幅上調(diào)，接種72 h時(shí)出現(xiàn)峰值，接種48～96 h N46處理的表達(dá)量與CK均呈顯著差異（Plt;0.05）

由圖11C可看出，接種48 h時(shí)，N46處理的由JA/SA誘導(dǎo)的與過敏反應(yīng)和細(xì)胞壁強(qiáng)化相關(guān)的基因（LOC111021192， peroxidase 2-like）的表達(dá)水平出現(xiàn)大幅上調(diào)，并在接種72 h達(dá)到峰值，比

CK高8.6倍，在接種96 h時(shí)略有下降，但仍比CK高8.7倍。各時(shí)期CK的表達(dá)水平均較低，接種48～96 h CK的表達(dá)水平與N46處理均呈顯著差異（Plt;0.05）。

2.2.6" 阻斷JA途徑對N46誘導(dǎo)苦瓜抗病性的影響" 對N46處理后的苦瓜使用IBU阻斷JA途徑，探究菌N46作用于苦瓜產(chǎn)生抗性誘導(dǎo)的依賴途徑，結(jié)果如圖12所示。施用無菌水再接種病原菌（A1）的病情指數(shù)為83，與僅施用IBU處理組（A2）和施用N46后涂抹IBU再接種病原菌（A4）處理組的病情指數(shù)無顯著差異，而N46處理的苦瓜病情指數(shù)僅39，與其他處理均呈差異顯著（Plt;0.05）。

3" 討論

因白粉病菌具有變異快、適應(yīng)性強(qiáng)的生物學(xué)特性，抗病育種和化學(xué)農(nóng)藥均面臨著難以繼續(xù)控制病害的局面。環(huán)保、可持續(xù)、高潛力的生物防治措施或?qū)⑹俏磥淼淖罴堰x擇。

近年來，芽孢桿菌屬微生物作為生物防治的熱點(diǎn)研究菌群，越來越多地被用于各種植物病害的控制。冉繼平等[24]從植物根際土壤中篩選到2株對刺梨白粉病具有突出防治效果的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和空氣芽孢桿菌（B. aerius）。謝德珊[25]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對小麥白粉病有良好的控制效果，在高濃度下的防效超過市售農(nóng)藥三唑酮，且對植物有較好的促生效果。楊東亞等[26]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）對黃瓜茄病鐮刀菌（Fusarium solani）具有良好的抑制效果。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）N46在6×108 CFU/mL濃度時(shí)對苦瓜白粉病具有顯著的防治效果，與上述研究結(jié)果較為相似。

楊勝清等[16]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌對植物病害的防治主要有直接作用（抑菌物質(zhì)的分泌）和間接作用（誘導(dǎo)植物抗性）2種方式。由于分泌的抗菌物質(zhì)本質(zhì)與化學(xué)農(nóng)藥無太大區(qū)別，且已有較多研究闡述，本研究的關(guān)注點(diǎn)集中在貝萊斯芽孢桿菌使植物產(chǎn)生的誘導(dǎo)抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌N46處理的苦瓜防御酶POD、CAT和SOD的活性在接種病原菌48 h時(shí)，出現(xiàn)大幅增加，且顯著高于CK。前期的研究表明，N46處理能有效防控白粉病在苦瓜上的發(fā)生，而進(jìn)一步研究表明，N46處理對苦瓜防御酶活性的變化幅度也顯著提高。這與前人研究發(fā)現(xiàn)的植物防御酶POD、CAT、SOD的活性高低及變化幅度在苦瓜中與其對白粉病的抗性呈正相關(guān)的規(guī)律[27]相吻合，與其他研究者在番茄作物上以芽孢桿菌處理植物獲得的規(guī)律[28]類似。表明N46處理對苦瓜白粉病的良好防治效果有一部分來源于植物的防御酶響應(yīng)變化的提升。本研究還觀察到N46處理的苦瓜在接種白粉病菌時(shí)比CK有更高的活性氧（ROS）積累率，而ROS在植物抗病中有著至關(guān)重要的作用，包括直接殺死病原菌、氧化交聯(lián)提高細(xì)胞壁強(qiáng)度、造成細(xì)胞過敏性壞死等[29]。被侵染的植物細(xì)胞過敏性壞死并強(qiáng)化周邊細(xì)胞的細(xì)胞壁可以有效阻止病害的傳播，這是植物抗病能力的表現(xiàn)。N46處理的過敏性壞死率顯著高于CK。木質(zhì)素沉積能使植物在受到病原菌侵害時(shí)加強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，限制病原菌的活動范圍，從而阻止病原菌的擴(kuò)散。甲苯胺藍(lán)染色后觀察到N46處理的木質(zhì)素積累率遠(yuǎn)高于CK，與白紅燕等[30]使用貝萊斯芽孢桿菌處理棉花作物時(shí)的表現(xiàn)類似。

本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測了抗病途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平，N46處理的JA反應(yīng)應(yīng)答的標(biāo)記性基因（LOC111018837）、SA反應(yīng)應(yīng)答的標(biāo)記性基因（LOC111017362）、由JA/SA誘導(dǎo)的與過敏反應(yīng)和細(xì)胞壁強(qiáng)化相關(guān)基因（LOC111021192）的表達(dá)量高于CK。N46處理的JA反應(yīng)應(yīng)答的標(biāo)記性基因表達(dá)量在0 h即與CK呈顯著差異，表明N46處理的苦瓜在未接觸病原菌時(shí)即保持了一定水平的抗性基因表達(dá)，但在本研究測定的生理生化指標(biāo)中并未表現(xiàn)出明顯差異，且在被病原菌侵染時(shí)抗病相關(guān)基因的表達(dá)量更高。這樣的“預(yù)啟動”效果在葫蘆科甜瓜作物[23]的誘導(dǎo)抗性研究中發(fā)現(xiàn)有類似的表現(xiàn)，“預(yù)啟動”不同于使植物一直保持高水平的防御動作，“預(yù)啟動”使植物僅在面對病原菌侵害時(shí)才觸發(fā)植物防御動作，且比未經(jīng)抗性誘導(dǎo)的植物反應(yīng)更快、更強(qiáng)。通過抑制JA反應(yīng)途徑使N46對苦瓜白粉病的防效幾乎消失，其染病嚴(yán)重程度與CK無顯著區(qū)別。這些結(jié)果表明依賴植物的JA途徑產(chǎn)生N46誘導(dǎo)的苦瓜抗病性，與在模式植物擬南芥[31]上得出的結(jié)論一致。而在抗病過程中也會使SA途徑的抗病性增強(qiáng)，所以N46使苦瓜對白粉病抗病性提高是JA途徑與SA途徑協(xié)同作用的結(jié)果。進(jìn)一步探究引起苦瓜抗病性的信號分子、植物細(xì)胞表面受體及其植物體中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，深入完整地揭示生物防治的作用機(jī)理是下一步的研究方向和目標(biāo)。

本研究通過盆栽苦瓜測定并確認(rèn)了貝萊斯芽孢桿菌N46對苦瓜白粉病的良好防治效果，進(jìn)一步探究了其防治機(jī)理，研究表明貝萊斯芽孢桿菌N46通過抑制葉面白粉病孢子萌發(fā)和誘導(dǎo)苦瓜葉片產(chǎn)生依賴于JA途徑的抗病性起到對白粉病的防治效果。

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