藻菌共培養(yǎng)體系微生物生長特性及互作轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類號：X826 文獻標志碼：A 文章編號：1674-3075（2025）04-0001-11

微藻是一種光合自養(yǎng)生物，在自然界中利用光合作用將無機碳轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)，并消耗硝酸鹽和磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)（Jaiswaletal，2023）。微藻不僅生長迅速、生長周期短，而且含有大量有機物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、脂質(zhì)等（Liuetal，2023）。微藻還可以處理富營養(yǎng)化水體，同時利用太陽能實現(xiàn)生物質(zhì)的生產(chǎn)，有些微藻甚至可以積累高達 50%～60% 的脂質(zhì)（Bhuyaretal，2021；Ferreiraetal，2022）。微藻生物質(zhì)中富含的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物等，經(jīng)處理可轉(zhuǎn)化為沼氣和生物乙醇，用作生物質(zhì)能源。因此，微藻在作為化石燃料替代方面具有巨大潛力（Aroraetal，2020；Chongetal，2022）。此外，微藻也是廢水生物處理的潛在物種，其在畜禽養(yǎng)殖廢水處理方面具有許多優(yōu)勢，如能耗低、成本低、抑制溫室氣體排放以及可用生物質(zhì)的形式回收養(yǎng)分等（Mohsenpouretal，2021；Sharmaetal，2022）。絲狀真菌，諸如曲霉菌等，具備產(chǎn)生多樣化活性物質(zhì)的能力，這些活性物質(zhì)在生物醫(yī)藥、生物防治以及食品等多個領域均得到了廣泛的應用（Vassauxetal，2019；白曉軒等，2024）。

由于微藻在自然條件下處于懸浮狀態(tài)，高成本和高能耗的微藻收獲限制了將微藻作為環(huán)境友好方法解決廢水和能源問題的實際應用（李雙喜和朱聯(lián)東，2023）。微藻與絲狀真菌共培養(yǎng)是一種新型的固定化模式，以能形成球粒的絲狀真菌為生物質(zhì)載體，微藻通過吸附和包囊的方式固定在真菌菌絲的表面或內(nèi)部。此外，絲狀真菌不僅充當了固定化微藻的載體材料，而且從生物量的角度來看，微藻和真菌通過互利共存方式增加生物量并降低培養(yǎng)成本。微藻光合作用產(chǎn)生的有機物和其他營養(yǎng)物可以為真菌提供養(yǎng)分，而真菌則保護微藻免受強光照的影響。同時，微藻產(chǎn)生的 O₂ 也可被真菌利用，而真菌釋放的CO₂ 則作為微藻的碳源，促進其光合作用（Guoetal，2017；Songetal，2022）。共培養(yǎng)體系相較于單獨的微藻或真菌培養(yǎng)體系，在廢水處理性能上更為優(yōu)越。微藻-真菌共培養(yǎng)還提高了對重金屬等污染物的耐受性（Chenetal，2023）。Li和Zhu（2023）研究了微藻-真菌共培養(yǎng)體系在 Cu（I） 的刺激下，對養(yǎng)豬廢水中總氮、總磷、化學需氧量及磺胺類抗生素的去除效果。結(jié)果表明，藻菌共培養(yǎng)對污染物有較高的耐受性和良好的去除效率，是一種具有潛力的畜禽養(yǎng)殖廢水處理方式。

目前，對于真菌孢子和微藻共培養(yǎng)體系的研究報道主要集中在相關參數(shù)的優(yōu)化、污染物耐受和去除效果，以及共培養(yǎng)過程中真菌對微藻的收獲效率。然而，在真菌和微藻共培養(yǎng)過程中的相互影響及作用機制方面鮮有深入研究。研究使用索羅金小球藻（Chlorellasorokiniana）和米曲霉（Aspergillusoryzae）孢子共培養(yǎng)，并采用互作轉(zhuǎn)錄組學技術，從分子層面分析了共培養(yǎng)體系中相關的差異基因表達，揭示了生物體的調(diào)控機制。研究目標包括：（1）通過不同真菌孢子和微藻的接種比例，探究共培養(yǎng)體系生物量及油脂含量的變化；（2）在不同真菌孢子和微藻接種比例下，研究共培養(yǎng)體系的生化組分變化，以及體系的微觀形態(tài)；（3）確定最佳接種條件，并通過互作轉(zhuǎn)錄組在分子層面分析真菌和微藻在共培養(yǎng)條件下的基因表達變化，揭示物種間的共培養(yǎng)關系。本研究優(yōu)化藻菌共培養(yǎng)條件，通過揭示微藻和真菌共培養(yǎng)關系及調(diào)控機制，旨在為藻菌共培養(yǎng)在廢水處理及生物質(zhì)采收等領域的應用提供技術參考。

1材料與方法

1.1實驗材料

研究采用的索羅金小球藻和米曲霉，購自中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心。微藻培養(yǎng)在BG-11培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件： （28±1）^°C ，光暗比 ，光照強度 4000lx 。真菌菌種保存在含有 3g/L 馬鈴薯提取液、 ?20g/L 葡萄糖和 20g/L 瓊脂粉的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA）中。真菌在微生物培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度 （28±1）^°C ，直到菌絲生長的孢子覆蓋固體培養(yǎng)基的表面。實驗使用含有 0.1% Tween-80的滅菌水將培養(yǎng)在PDA上的米曲霉孢子沖下，并接種于 250mL 錐形瓶中。錐形瓶中含有100mLBG-11+0.5g/L 葡萄糖（COD約為 500mg/L） 的無菌液體培養(yǎng)基。實驗中，將接種了微藻和真菌孢子的培養(yǎng)基放入恒溫震蕩光照培養(yǎng)箱中進行無菌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 25°C，130r/min 和 4000lx 。

1.2實驗設計

在藻菌干重測定、油脂、胞內(nèi)蛋白、胞內(nèi)多糖測定以及光合色素測定實驗中，研究設置5種菌藻比例（1：10、1：5、1：2、1：1、2：1，控制微藻初始接種 OD₆₈₀ 為0.15，調(diào)整真菌孢子初始接種濃度）進行共培養(yǎng)，為期96h ，確定最優(yōu)接種比例。藻細胞密度和真菌孢子密度分別通過公式 ① 和公式 ② 計算得出（李雙喜，2022；Liuetal，2023）。

C_a=2×10¹⁰×O₆₈₀-0.04（R²=0.9994）

C_f=2×10¹⁰×O₆₅₀（R²=0.9928）

式中： C_a 為藻細胞濃度（個/L）； C_f 為真菌孢子數(shù)（個/L）； O₆₈₀ 和 O₆₅₀ 分別為波長 680nm 和 650nm 下的光密度OD值； OD₆₈₀ 和 OD₆₅₀ 的轉(zhuǎn)換因子均通過標準曲線法標定，得到 2×10¹⁰ 個/L。

在轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炛?，分別設置單藻培養(yǎng)和單菌培養(yǎng)作為對照組，將其與處于最優(yōu)接種比例下的藻菌共培養(yǎng)體系進行對比分析，探究微藻與真菌間的相互作用，從分子層面揭示共培養(yǎng)中基因表達的差異及其對生長與代謝的影響。

為便于清晰對比和分析不同培養(yǎng)條件下微藻和真菌的基因表達差異，定義了特定的對比組標識。其中，Mock組代表微藻或真菌在共培養(yǎng)組中的基因表達數(shù)量，CS代表單獨培養(yǎng)索羅金小球藻的基因表達數(shù)量，AO代表單獨培養(yǎng)米曲霉的基因表達數(shù)量。MockvsCS表示將共培養(yǎng)體系中索羅金小球藻的基因表達情況與單獨培養(yǎng)索羅金小球藻時的基因表達情況進行對比；MockvsAO則表示把共培養(yǎng)體系中米曲霉的基因表達情況和單獨培養(yǎng)米曲霉時的基因表達情況作對比。針對這2個對比組進行表達量的差異倍數(shù)分析，制作火山圖來展示差異表達基因的情況。

1.3實驗方法

1.3.1藻菌干重測 定微藻和真菌干重在培養(yǎng)第96 小時測定。準確取 5mL 均勻混合的微藻-真菌共培養(yǎng)體系溶液樣品，將其轉(zhuǎn)移至事先稱重并記錄的 10mL 離心管中。隨后，將裝有樣品的離心管放入離心機，并在 8 000r/min 的條件下離心 10min 。離心完成后倒掉離心管中的上清液，并將離心管與其中的沉淀物一同放入烘箱中，直至完全干燥。最后，計算微藻-真菌樣品的干重，計算公式如下：

M=（M_b-M_a）/V₁

式中： M 為藻菌樣品干重 Γ（g/L）;M_a 為離心管初始干重 （mg）;M_b 為離心管加藻菌總重 （mg）;V₁ 為樣品體積（L）。

1.3.2藻菌油脂測定取 15mL 微藻-真菌共培養(yǎng)液置于離心管中，用超聲波破碎細胞， 8000r/min 離心 10min 后去上清液。加 25mL 氯仿/甲醇（2：1），150r/min 振蕩 ³h 混合油脂與溶劑。再加入 5mL 0.9% NaCl，漩渦震蕩 3min 后，再次 8000r/min 離心 10min 。樣品分3層，用注射器抽取下層油相至離心管，氮氣吹干后稱重。最后，根據(jù)以下公式計算油脂含量。

M_f=（M_l-M₀）/（V_?×M）

式中： M_f 為油脂含量 ?mg/g? ： M₀ 為離心管初始干重 （log）;M₁ 為離心管加油脂總重 ）； V₂ 為樣品體積（L）; M 為藻菌的干重 Π（g/L） 。

1.3.3胞內(nèi)蛋白質(zhì)及多糖測定為測定胞內(nèi)蛋白質(zhì)與多糖，需進行細胞破碎預處理。取 5mL 藻液， 4^°C 下 8000r/min 離心 10min ，去上清液得到微藻細胞沉淀。加 5mLpH7.0 磷酸緩沖液，重懸后，用超聲波細胞破碎儀冰浴破碎 5min ，超聲-間歇循環(huán)為4s-4s。

蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍法，比較待測樣品與空白、標準樣的 OD₅₉₅ 值確定濃度。胞外多糖測定用硫酸-蒽酮法， 0.2g 蒽酮溶于 100mL 濃硫酸，隨用隨制，避光處理。取 1mL 上清液與 4mL 硫酸-蔥酮混合， 95^°C 加熱 10min 后冷卻，用紫外分光光度計測 650nm 吸光值。通過下述公式計算待測樣品的多糖含量：

C_p=（O₆₂₀-0.0027）/6.854

式中： C_p 為多糖濃度 （g/L） ; O₆₂₀ 為 OD₆₂₀ 值。

1.3.4光合色素測定取 5mL 樣品， 4^°C 下 8000r/min 離心 5min ，去上清液。沉淀用 90% 丙酮懸浮， 4^°C 冷藏 24h ，期間多次搖動。再離心 5min ，用紫外分光光度計測上清液在665、652和 470nm 的吸光度。通過下列公式計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的濃度。

式中： C_a，C_b 和 C_c 為葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿h 素含量 （mg/L） ，可通過665、652和 470nm 波長下的吸光度值 （A₆₆₅?A₆₅₂?A₄₇₀） 計算得出。將計算結(jié)果除以索羅金小球藻的干重，即可得到微藻細胞中光合色素的含量 （mg/g） 。

1.3.5表面形貌使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察真菌、微藻及共培養(yǎng)狀態(tài)。離心后，用 4^°C 預冷的3% 茂二醛固定樣品 2h ，吸出固定劑，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗滌2次。再用4% 多聚甲醛固定 ^4h ，再次PBS洗滌。隨后，用系列梯度乙醇 （30%50%70%80%90%95%100%） 脫水，每種濃度2次，每次 15min 。干燥后，將樣品涂于導電膠上，噴金以增強導電性。最后，將樣品置于SEM下，使用不同放大倍數(shù)觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.6轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。研究使用共培養(yǎng) 96h 后的藻菌樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。從樣本中提取總RNA，確保質(zhì)量和完整性后，采用OligodT磁珠富集mRNA，以適應IlluminaNovaseq60oo平臺的測序需求。接著，將mRNA片段化并篩選約 300bp 的小片段，隨后通過逆轉(zhuǎn)錄生成雙鏈cDNA并連接接頭。再經(jīng)過PCR擴增、純化、定量混合及橋式PCR擴增等步驟，最終在Illumina平臺上進行 2×150 bp的測序。

2結(jié)果與分析

2.1微藻-真菌共培養(yǎng)體系形貌

利用SEM觀察真菌小球菌絲、微藻和藻菌小球培養(yǎng)96h后的形貌，見圖1。真菌小球由真菌孢子生長形成的菌絲經(jīng)外力攪拌作用纏繞在一起，形成內(nèi)部較為疏松的球狀物體（圖1a和1b）。這種疏松的菌絲結(jié)構(gòu)為微藻提供了附著的場所。而索羅金小球藻是一種直徑約 3μm 的球狀微藻（圖1c和1d）。藻菌共培養(yǎng)形成小球的微觀形貌（圖1e、1f顯示，大量微藻細胞牢固附著在真菌菌絲上。真菌和微藻會分泌一些胞外聚合物（EPS），這些EPS富含多糖、蛋白質(zhì)和核酸等成分，能夠在細胞間起到“膠水”的作用，促進細胞之間的相互黏附與聚集，進而形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這一獨特的結(jié)構(gòu)不僅增強了藻菌體系的穩(wěn)定性，也為物質(zhì)交換和代謝活動提供了便利條件（李雙喜，2022）。同時，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的存在增加了藻菌小球的表面積，顯著提升了生物對污染物的吸附和富集效能。真菌小球通過從外部到內(nèi)部的生物絮凝作用包裹微藻細胞，形成復雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進一步表明絲狀真菌可用作固定和收獲微藻的生物載體。

2.2微藻-真菌共培養(yǎng)體系生物量

真菌孢子和微藻的初始接種比例對共培養(yǎng)體系的生長影響顯著（Yangetal，2019）。在最佳菌藻比例下，兩者相互作用，進一步促使雙方達到最佳的生長狀態(tài)。微藻可以通過光合作用固定 CO₂ ，生成的有機化合物會在分泌或者死亡后釋放到體外，進而促進真菌的生長；真菌的菌絲則會將微藻細胞包裹在真菌小球中，形成一種相互促進的關系（Lengetal，2021）。然而不適當?shù)慕臃N比例可能導致一方因資源競爭優(yōu)勢過度生長，破壞體系平衡。

為了深入了解這種相互作用，本研究評估了不同微藻-真菌孢子接種比例下，共培養(yǎng)體系的生物量和油脂積累情況。結(jié)果表明（圖2），就生物量而言，1：1是微藻和真菌孢子共培養(yǎng)的最佳接種比例。當菌藻接種比例從2：1降至1：10時，生物量從 0.47g/L 降低至0.39g/L 。隨著真菌孢子接種比例的升高，藻菌共培養(yǎng)體系的生物量同步增加，表明在培養(yǎng)過程中真菌的圖中字母表示統(tǒng)計學差異，相同字母組間無顯著差異 （Pgt;0.05） ，不同字母組間存在顯著差異 （Plt;0.05） 。

生物量增長高于微藻。此外，生物量組成也會受到接種比例的影響。在實際應用中，為了在混合生物質(zhì)中提高微藻或真菌的百分比，可以相應地調(diào)整接種比例。

在對微菌共培養(yǎng)體系的生化組分分析中，油脂含量是一項極為關鍵的考量指標。一方面，油脂作為生物能源的核心原料，其含量高低直接關乎該共培養(yǎng)體系在生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化等能源領域的應用潛力；另一方面，共培養(yǎng)過程中油脂含量的動態(tài)變化，能直觀反映出微藻和真菌之間復雜的代謝交互關系，有助于深入探究共培養(yǎng)的內(nèi)在機制。Muradov等（2015）研究指出，使用小球藻（Chlorellaprotothecoides）單藻培養(yǎng)時可獲得油脂 699.7mg/L ，而使用煙曲霉（Aspergillusfumigatus）單菌培養(yǎng)油脂僅 240.20mg/L 。在藻菌共培養(yǎng)體系中，其油脂含量卻能夠提升至2 041.96mg/L ，證明了藻菌共培養(yǎng)可以顯著提升油脂含量。如圖2所示，在菌藻接種比為1：10、1：5、1：2和1：1時藻菌共培養(yǎng)體系的油脂含量變化并不顯著。然而，在菌藻接種比例達到2：1時，油脂含量卻顯著下降。表明真菌比例過高，會抑制微藻脂肪合成，導致藻菌系統(tǒng)中油脂含量顯著減少。

2.3微藻-真菌共培養(yǎng)體系生化組分

研究分析了不同真菌孢子-微藻接種比例對共培養(yǎng)體系生化組分的影響，包括胞內(nèi)蛋白質(zhì)、多糖及光合色素含量。結(jié)果表明，接種比例顯著影響生長干重、胞內(nèi)蛋白質(zhì)和多糖含量。隨著真菌孢子比例增加，胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量減少，多糖含量也顯著下降（表1）。

索羅金小球藻富含油脂、蛋白質(zhì)和多糖，其生物量升高時，共培養(yǎng)體系中油脂、蛋白質(zhì)和多糖的含量也隨之增加。具體而言，當菌藻比例從1：10提高到2：1時，藻菌體系的胞內(nèi)多糖含量顯著降低，從413.81mg/g 減少至 169.95mg/g 。這一降低趨勢與微藻在體系中的相對生物量減少相一致。

研究測定了共培養(yǎng)體系中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，以反映微藻生物量變化。如圖3，隨著菌藻比例增加，光合色素含量遞減。菌藻比從1：10升至2：1時，葉綠素a從 3.59mg/L 減至 0.80mg/L ，葉綠素b從 1.40mg/L 減至 0.14mg/L ，類胡蘿卜素從1.54mg/L 減至 0.37mg/L 。這表明隨著菌藻比增大，微藻光合色素含量降低。

圖中字母表示統(tǒng)計學差異，相同字母組間無顯著差異 （Pgt;0.05） 。不同字母組間存在顯著差異 （Plt;0.05） 。

在共培養(yǎng)體系中，微藻固定在真菌小球的菌絲上，雙方的氣體交換和養(yǎng)分共享分別增強了個體的代謝活動，同時真菌菌絲還可以為微藻提供保護（Caoetal，2022）。然而，當真菌孢子接種比例過高時，會導致微藻的生物量積累減小?？赡艿脑蚴沁^量的真菌生物量積累迅速，占據(jù)優(yōu)勢地位，并遮擋了光線，從而抑制了微藻的生長，導致兩者生長嚴重不均衡?；谏鲜鼋Y(jié)果，真菌和微藻在1：10的接種比例下可實現(xiàn)最佳的共培養(yǎng)效果。

2.4互作轉(zhuǎn)錄組分析

微藻-真菌孢子共培養(yǎng)是微藻和真菌孢子相互作用生長增殖并形成藻菌小球的過程（李雙喜和朱聯(lián)東，2023）。目前，大多數(shù)相關文章聚焦于研究外源有機物的調(diào)控作用，以及污染物對藻菌共培養(yǎng)體系構(gòu)建的影響與毒理機制（Liamp;Zhu，2023；Wuetal，2024），而本文則更多探究藻菌共培養(yǎng)對二者自身生理過程的影響。在共培養(yǎng)過程中，微藻和真菌之間可能存在原始的合作、競爭甚至偏害等相互作用。

（Palmeramp;Foster，2022），進而影響雙方的新陳代謝和細胞通訊。從分子層面來看，微藻和真菌在這種共培養(yǎng)體系中可能表現(xiàn)出基因表達的差異。因此，對微藻-真菌孢子共培養(yǎng)體系進行細胞互作的轉(zhuǎn)錄組分析具有重要的學術價值，可以深入了解共培養(yǎng)體系中微藻和真菌的生物學特性。

2.4.1表達量差異分析為了獲得索羅金小球藻和米曲霉共培養(yǎng)與單獨培養(yǎng)之間的差異基因，本研究分別對共培養(yǎng)體系（Mock組）及單藻（CS組）、單菌（AO組）培養(yǎng)進行了靶向轉(zhuǎn)錄組學測序。結(jié)果見表2。

針對這2個對比組，進行表達量的差異倍數(shù)分析，并制作火山圖（圖4）。在圖中，藍色和紅色點分別代表表達量顯著下調(diào)和上調(diào)的差異表達基因，而灰色點表示無顯著變化的差異表達基因。Mock_vs_CS和Mock_vs_AO對比組的log2FC分別為：-13.20＼～9.59和-9.54＼～10.12。對差異表達基因的分析發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)中，米曲霉上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因更多，同時部分差異基因變化也更為顯著。

2.4.2GO富集分析GO注釋分析呈現(xiàn)了索羅金小球藻和米曲霉中前20條通路（圖5a）。這些通路涵蓋了7個分子生物學功能項（molecularfunction）、7個細胞學組分項（cellularcomponent）和6個生物學過程項（biologicalprocess）。在共培養(yǎng)體系中，索羅金小球藻的分子生物學功能呈現(xiàn)出顯著的差異表達，其中結(jié)合方面涉及到的差異表達基因高達1212個，而催化活性方面則涉及到1447個基因的顯著變化。在細胞學組分層面，差異表達基因的關注點主要聚焦在細胞成分（939個基因）和細胞膜成分（1000個基因）。同時，從生物學過程角度看，差異表達基因主要集中在細胞過程（1006個基因）和代謝過程（1008個基因）。相對而言，米曲霉在分子生物學功能方面呈現(xiàn)出與索羅金小球藻相似的趨勢。差異表達基因的最大集中領域分別為結(jié)合（1327個基因）和催化活性（1705個基因）。在細胞學組分方面，米曲霉的關鍵差異表達基因主要涉及細胞成分（874個基因）和細胞膜成分（950個基因）。此外，生物學過程的分析顯示，差異表達基因主要分布在代謝過程（1029個基因）和細胞過程（1036個基因）方面。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，可以觀察到在藻菌共培養(yǎng)體系中，差異表達基因的功能注釋普遍涉及生長發(fā)育和細胞代謝活動等方面。具體而言，涉及到結(jié)合和催化活性的基因可能參與了細胞生長和代謝通路中的關鍵步驟。同時，在細胞學組分方面，與細胞成分和細胞膜成分相關的基因可能影響了細胞結(jié)構(gòu)和膜的功能。此外，在生物學過程方面，代謝過程和細胞過程的差異表達基因可能參與了調(diào)節(jié)細胞代謝和生物學過程的關鍵活動。功能注釋表明，共培養(yǎng)體系中的生物體在分子水平上對于生長、發(fā)育和代謝等生物學過程做出了有意義的調(diào)整。

進一步富集分析（圖5b）表明，在微藻-真菌孢子共培養(yǎng)條件下，索羅金小球藻膜的完整性（integralcomponentofmembrane）以及物質(zhì)跨膜運輸（trans-membranetransport），均呈現(xiàn)出不同程度的促進效應。同時，共培養(yǎng)也顯著促進了微藻中甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase）的活性。甲基轉(zhuǎn)移酶作為一類在細胞內(nèi)扮演重要催化角色的酶，其主要功能在于直接促使甲基化堿基的修復，參與遺傳物質(zhì)修飾、基因表達、系統(tǒng)發(fā)育、細胞信號轉(zhuǎn)導、蛋白質(zhì)運輸以及生物活性分子的合成與修飾等多種生物過程（熊佳欣等，2024）。這一過程作為DNA修復的關鍵環(huán)節(jié)，對于維護DNA分子中甲基化堿基的修復和基因組的穩(wěn)定性至關重要（劉嘉琦等，2023）。這表明在共培養(yǎng)體系中，微藻會通過調(diào)控自身酶活性進而改變自身生理活性。相對而言，在共培養(yǎng)體系中，米曲霉膜的完整性和單加氧酶（monooxygenase）活性均受到不同程度的促進，但碳水化合物代謝過程（carbohydratemetabolicprocess）和氧化還原酶（oxidoreductase）活性等方面受到了抑制。氧化還原酶作為一類催化氧化還原反應的酶，參與多種代謝途徑，包括能量代謝、有機物降解和抗氧化防御等。在真菌中，氧化還原酶的功能廣泛，可將有機物氧化為二氧化碳和水以釋放能量，還能分解有毒物質(zhì)，保護真菌免受有害物質(zhì)侵害（Naray-ananetal，2023）。碳水化合物代謝過程受到抑制的原因可能是由于真菌所獲得的有機碳源減少，從而導致其能量代謝水平下降?？傮w而言，共培養(yǎng)體系中微藻和真菌之間存在對有機物的競爭，導致其獲得的有機物量相較于單獨培養(yǎng)情況減少，進而對它們的生理代謝過程產(chǎn)生了影響。未來研究也可進一步拓展篩選范圍，選擇不同種類的微藻與真菌，同時設置多組實驗分別添加不同濃度或不同種類的有機物，探索如何最大程度地促進藻菌協(xié)同效應，降低二者在利用有機物等資源時的競爭，從而為優(yōu)化藻菌共培養(yǎng)體系提供更具針對性的理論依據(jù)和實踐指導。

2.4.3KEGG富集分析將測序得到的基因類型和數(shù)量與KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)合，進行KEGG功能預測分析，結(jié)果如圖6a。KEGG注釋分別展示了索羅金小球藻和米曲霉中前18條和20條通路。這些通路涵蓋了生物系統(tǒng)（organismalsystems）、環(huán)境信息處理（environmentalinformationprocessing）、遺傳信息處理（genetic information processing）、細胞過程（cel-lularprocesses）和新陳代謝（metabolism）等關鍵生物學信息。在藻菌共培養(yǎng)體系中，索羅金小球藻的差異基因主要被注釋到遺傳信息處理中的轉(zhuǎn)譯（90個基因）、折疊/分類與降解（87個基因），以及新陳代謝中的輔助因子和維生素代謝（74個基因）、碳水化合物代謝（91個基因）等通路。米曲霉中的差異基因則主要注釋到新陳代謝中的氨基酸代謝（150個基因）

和碳水化合物代謝（209個基因）等通路。這些注釋結(jié)果為深入理解微藻-真菌孢子共培養(yǎng)體系中索羅金小球藻和米曲霉之間的互作關系提供了有益的信息。特別是在轉(zhuǎn)錄組水平上注釋到的通路，揭示了在共培養(yǎng)條件下，這2種生物體可能通過調(diào)控特定的基因通路來適應共同生存的環(huán)境，進而影響生物學功能和代謝過程。

KEGG通路富集氣泡圖（圖6b）揭示了共培養(yǎng)體系中索羅金小球藻和米曲霉的差異表達通路。索羅金小球藻的前5個顯著差異的代謝通路涉及到真核生物核糖體的生物合成、蛋白質(zhì)輸出、RNA聚合酶活性、卟啉及葉綠素代謝和輔助因子的生物合成。說明共培養(yǎng)顯著影響了微藻的生理活動，調(diào)節(jié)了RNA的合成通路相關基因表達，進而促進蛋白質(zhì)代謝和細胞增殖，但光合色素的合成卻受到抑制（表3）。有研究表明，遮光會導致植物的光合色素降低，光能傳遞和轉(zhuǎn)化受限（鄧施琴等，2024）。推斷在共培養(yǎng)情況下，真菌的菌絲會產(chǎn)生遮光效應，而且被菌絲捕獲的微藻會聚集形成團簇，這不僅阻礙了光線的穿透，還限制了微藻對光的有效利用，進而影響葉綠體內(nèi)光合色素的合成。米曲霉的顯著差異代謝通路涉及到DNA復制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、長壽調(diào)節(jié)途徑、三羧酸循環(huán)和錯配修復（圖6b）。其中，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工路徑的差異基因數(shù)量最為顯著。這一結(jié)果表明，共培養(yǎng)促進了真菌的蛋白合成（表3），這對于真菌的生長、發(fā)育以及維持其細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。然而，米曲霉的三羧酸循環(huán)卻呈抑制趨勢（表3）。這表明在共培養(yǎng)的情況下，培養(yǎng)基中的葡萄糖等有機碳源可能受到微藻的競爭，導致真菌對葡萄糖的吸收和利用減少，這一結(jié)果和GO富集分析一致。說明需要謹慎設置藻菌的接種和培養(yǎng)比例，避免在共培養(yǎng)體系下一方過度占優(yōu)勢，導致共培養(yǎng)體系的失衡。

3結(jié)論

通過優(yōu)化索羅金小球藻和米曲霉孢子的接種比例，構(gòu)建微藻-真菌孢子共培養(yǎng)體系，并對不同接種比例條件下 96h 培養(yǎng)后的生物量、生化組分及微觀形態(tài)進行分析。結(jié)果顯示，真菌孢子和微藻的初始接種比例顯著影響藻菌體系的生物量和生化組分。培養(yǎng)過程中真菌生物量的增加高于微藻，而微藻的油脂、蛋白質(zhì)和多糖含量更豐富。通過SEM分析共培養(yǎng)表面形貌發(fā)現(xiàn)，真菌菌絲通過粘附或包裹微藻，形成復雜的三維球狀結(jié)構(gòu)，為雙方的氣體交換和營養(yǎng)物質(zhì)流動提供基礎。轉(zhuǎn)錄組分析揭示了微藻-真菌孢子共培養(yǎng)體系中藻菌相互作用的分子機制。在共培養(yǎng)條件下，索羅金小球藻的甲基轉(zhuǎn)移酶活性增強、與RNA合成相關的基因上調(diào)，促進了微藻細胞蛋白質(zhì)合成與增殖，但光合色素合成受抑制。米曲霉的蛋白質(zhì)合成相關基因顯著上調(diào)，增強了真菌的抗逆性。然而，米曲霉的碳水化合物代謝和三羧酸循環(huán)受到抑制，表明在共培養(yǎng)中微藻和真菌之間存在對有機物的競爭。研究成果有助于深入挖掘微藻與真菌在共培養(yǎng)體系中的相互作用機制，為藻菌體系在微藻生物質(zhì)采收、環(huán)境修復等領域的應用提供科學依據(jù)。

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Microbial Growth Characteristics and Interaction Transcriptome Analysis of a Co-cultivation System of Microalgae and Fungi

LIUDongyang1，2， XUE Yinghao2， ZHULiandong1 （1.School of Resource and Environmental Sciences， Wuhan University， Wuhan 430079，P.R. China; 2.Rural Energy and Environment Agency， Ministry ofAgriculture and Rural Affairs，Beijing 100125，P.R. China）

Abstract：Microalgal-fungal co-cultivation has wide applications in many fields such as microalgae harvesting and wastewater treatment.In this study，a microalgal-fungal co-cultivation system was established using Chlorella sorokiniana and Aspergillus oryzae，and we analyzed the microbial growth characteristics and explored symbiotic relationships and regulatory mechanisms between the microalgae and fungi，aiming to optimize algal-fungal co-culture conditions.Five inoculation ratios of A.oryzae cells to C.sorokiniana spores （1：10，1：5，1：2，1：1，2：1） were prepared and the biomass，cellular content of biomolecules （lipids， proteins，and polysaccharides），and the microscopic morphology of A . oryzae and C. sorokiniana were observed after 96h .The co-culture of C ， sorokiniana and A . oryzae at the optimal inoculation ratio was then compared with axenic cultures of C. sorokiniana and A .oryzae.Differences in gene expression and the eects of microalgae-fungi interactions on growth and metabolism at the molecular level were clarified by interaction transcriptome analysis.The initial co-culture ratio of fungi to microalgae significantly influenced the biomass and biomolecular content of the co-cultivation system， and the optimal co-culture ratio was 1：1. After 96h ，fungi biomass exceeded microalgae biomass， and a decrease in the initial proportion of fungi resulted a reduction in the final total biomass.When the ratio of fungi to algae was reduced from 2：1 to 1：10， the overall biomass decreased from 0.47g/L to 0.39g/L Microalgae were rich in lipids，proteins，and polysaccharides，and a decrease in the microalgae inoculation ratio reduced the cellular content of biomolecules.When the ratio of fungi spores to algae cells was increased from 1：10 to 2：1，intracellular polysaccharide content in the co-cultivation system significantly decreased， from 413.81mg/g to 169.95mg/g SEM analysisrevealed the C sorokiniana adhered to A . oryzae hyphae， forming a three-dimensional structure that enhanced gas exchange and nutrient flow between C. sorokiniana and A . oryzae. Transcriptome analysis of mutual interactions indicated that， under co-cultivation conditions， the genes of C ：sorokiniana related to methyltransferase and RNA synthesis were significantly upregulated， while the photosynthetic pigment genes were downregulated. This result indicates that co-culture enhances the proliferation of microalgae but reduces light utilization. In the co-cultivation system，carbohydrate metabolism and the TCA cycle ofA. oryzae were inhibited，indicating a competition between microalgae and fungi for organic mater in the co-cultivation system. This study elucidated microbial growth characteristics and interactions between microalgae and fungi in diferent co-cultivation systems，and provides technical guidance for the application of microalgal-fungal co-cultivation systems in wastewater treatment and microalgae biomass harvesting.

Key words： Chlorella sorokiniana; Aspergillus oryzae; co-cultivation; transcriptomics; growth characteristics