蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)分析

中圖分類號(hào)：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-7897（2025）11-0004-03

0引言

蝴蝶蘭屬于蘭科蝴蝶蘭屬的一類花卉植物，最早出現(xiàn)于熱帶雨林地區(qū)，本身具備喜暖畏寒特性，該花卉植物可長(zhǎng)至 50cm ，每個(gè)短莖可見3枚左右葉片。在實(shí)際栽培作業(yè)中，該植物常因感染齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossumringspotvirus，ORsV）與建蘭花葉病毒（Cymbidiummosaicvirus，CyMV）影響培育質(zhì)量，故經(jīng)過采用花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)，能夠有效抑制病毒對(duì)植物長(zhǎng)勢(shì)及成活率的不利影響，使其在脫毒劑有效作用下保持最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，為組培快繁活動(dòng)的開展提供明確的技術(shù)指導(dǎo)，滿足高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)培育需求。

1蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)要點(diǎn)

蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)的實(shí)踐應(yīng)用，主要是為了改善蝴蝶蘭花卉植物的培育質(zhì)量，體現(xiàn)花梗腋芽脫毒價(jià)值，以符合高質(zhì)量、高效培育標(biāo)準(zhǔn)。在該技術(shù)應(yīng)用階段，技術(shù)人員有必要深刻掌握技術(shù)要點(diǎn)，以達(dá)到預(yù)期培育效果，充分展現(xiàn)該技術(shù)的實(shí)用價(jià)值。

1.1花梗腋芽培養(yǎng)技術(shù)

出于改善蝴蝶蘭培育質(zhì)量的目的，技術(shù)人員可充分運(yùn)用花梗腋芽培養(yǎng)技術(shù)，了解與花梗腋芽萌發(fā)率關(guān)聯(lián)密切的影響因素，而后在脫毒操作中，確保在脫毒劑助力下提高萌發(fā)率。經(jīng)過相關(guān)研究，可根據(jù)蝴蝶蘭花梗腋芽培養(yǎng)過程的取材時(shí)間、取材部位、培養(yǎng)基成分等內(nèi)容歸納技術(shù)要點(diǎn)。蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)的核心在于外植體的高效活化與無菌體系構(gòu)建。本研究針對(duì)開花花梗腋芽的生物學(xué)特性，系統(tǒng)性優(yōu)化了取材定位、消毒程序及培養(yǎng)基配方三大關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相關(guān)分析如下。

1.1.1取材定位的解剖學(xué)依據(jù)

根據(jù)蝴蝶蘭花梗發(fā)育規(guī)律，開花后30＼～45d的花梗進(jìn)入生理成熟期，其腋芽分生組織細(xì)胞處于活性峰值。本試驗(yàn)選取‘大辣椒'品種開花后35d的健康花梗，依據(jù)解剖學(xué)特征將其劃分為3個(gè)功能區(qū)域。

（1上部（距頂端 5-10（m） ：維管束密集，芽點(diǎn)飽滿，分生組織直徑 0.5-0.8mm 0

（②中部（距頂端 10-20（m） ：維管束間距增大，芽點(diǎn)部分被苞片包裹。

③下部（距頂端 20～30cm） ：木質(zhì)化程度高，芽點(diǎn)呈休眠態(tài)。

1.1.2階梯式消毒程序優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花梗表面溝壑結(jié)構(gòu)易藏匿病原菌，需采用復(fù)合消毒策略。

（1）物理清潔：用軟毛刷蘸取含 0.05% Triton X-100的清洗液 Λ（pH 為6.8）刷洗 3min ，去除表面蠟質(zhì)層。

（②化學(xué)滅菌：重點(diǎn)比較乙醇-升汞（方案A）與次氯酸鈉-抗生素（方案B的效果差異，如表1所示。

表1數(shù)據(jù)表明，方案B的抗生素輔助處理可顯著降低污染率 （pΔ0.01） ，這可能是由于頭孢噻肟能滲透至維管束殺滅內(nèi)生菌。最終確定方案B為最優(yōu)消毒程序，但需注意次氯酸鈉處理時(shí)間，若超過 20min 會(huì)引發(fā)細(xì)胞質(zhì)壁分離。

1.1.3培養(yǎng)基配方的響應(yīng)面優(yōu)化

在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)3種關(guān)鍵添加物進(jìn)行優(yōu)化。

（1）自變量：椰子汁 （X₁：10～309/L） 、6-BA （X₂;0.5～ 2.0mg/L） 、活性炭 。

（2）響應(yīng)值：萌發(fā)率 Y₁ 、增殖系數(shù) Y₂ 0多組試驗(yàn)構(gòu)建二次多項(xiàng)式模型，具體如下：

0.932） ;

當(dāng)椰子汁濃度達(dá)25g/L、6-BA濃度達(dá)到 1.5mg/L. 活性炭 0.3g/L 時(shí)，萌發(fā)率可達(dá) （82.6±3.2）% ，較基礎(chǔ)配方提升了 37.4% 。此配比下，分生組織細(xì)胞在培養(yǎng)7d后即出現(xiàn)明顯膨大，14d后可見2＼～3個(gè)新生芽點(diǎn)。

1.1.4環(huán)境參數(shù)的精準(zhǔn)控制

通過正交試驗(yàn)L9（3探究溫度、光照、濕度3個(gè)因素影響，具體如表2所示。

環(huán)境參數(shù)正交試驗(yàn)極差分析如表3所示。溫度對(duì)萌發(fā)率的貢獻(xiàn)率達(dá) 47.3%（F=12.85，plt;0.01） ，這與蝴蝶蘭景天酸代謝（Crassulaceanacidmetabolism，CAM）代謝途徑的酶活性溫度閾值直接相關(guān)。最終確定最優(yōu)組合為：晝溫 28% 夜溫 23% 、光照 1500Lx（16h/d） 、濕度70% ，此條件下腋芽萌發(fā)時(shí)間可縮短至 （18.3±1.5）d 。

1.1.5技術(shù)驗(yàn)證與穩(wěn)定性測(cè)試

對(duì)優(yōu)化后的技術(shù)體系進(jìn)行3批次重復(fù)試驗(yàn)（每批次 n=100） ，結(jié)果顯示：平均萌發(fā)率為 （80.3±2.8）% （相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 3.5% ；污染率 ?5% ；褐化率 ≤10% 。電鏡觀察顯示，優(yōu)化組腋芽分生組織細(xì)胞線粒體數(shù)量較對(duì)照組增加2.3倍，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)更為發(fā)達(dá)，表明能量代謝水平顯著提升。 RT-qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素響應(yīng)基因（AUX/IAA）表達(dá)量上調(diào)4.7倍，細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶IPT表達(dá)量上調(diào)3.2倍，從分子層面驗(yàn)證了技術(shù)體系的有效性。

1.2莖尖梯度脫毒技術(shù)體系

蝴蝶蘭病毒脫除需基于分生組織病毒分布梯度特性，采用“物理剝離-熱激誘導(dǎo)\"的協(xié)同脫毒策略。實(shí)際操作中，選取經(jīng)預(yù)處理的健康莖尖，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行三級(jí)梯度剝離：首先，用顯微手術(shù)刀切除外層2＼～3片葉原基，保留直徑約 1.0mm 的莖尖圓錐體；其次，在40倍解剖鏡下沿維管束切線方向削除基部 0.2mm 組織，消除潛藏病毒粒子的薄壁細(xì)胞；最后，使用 0.05mm 鎢絲針精確剔除分生區(qū)邊緣可能殘留病毒的過渡細(xì)胞，獲得直徑 0.3-0.5mm 的無菌分生組織。此過程需在15min內(nèi)完成，避免外植體氧化褐化。脫毒核心環(huán)節(jié)采用動(dòng)態(tài)熱激處理：將剝離后的莖尖接種于改良KnudsonC培養(yǎng)基（含 0.5mg/LΛ6-BA+0.1mg/L 萘乙酸），初始3d 維持25^°C 促進(jìn)細(xì)胞代謝恢復(fù)，隨后每日升溫 2^°C 至 38°C 恒溫狀態(tài)，持續(xù)處理21d。熱激第7d向培養(yǎng)基添加 0.1μmol/L 水楊酸與 0.05% 氨基寡糖素復(fù)合誘導(dǎo)劑，前者通過激活病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis related protein，PR protein）切割病毒RNA，后者增強(qiáng)細(xì)胞壁胼胝質(zhì)沉積形成物理屏障。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示， 38^°C 處理使病毒外殼蛋白（coatprotein，CP）熱變性效率達(dá) 92.7% ，配合化學(xué)誘導(dǎo)劑可將ORSV脫毒率提升至 93.5% 。實(shí)際操作中需嚴(yán)格監(jiān)控兩點(diǎn)：培養(yǎng)基滲透壓維持在 280～300mOsm/kg 防止高溫脫水，氨基寡糖素濃度不超過 0.05% 以避免細(xì)胞程序性死亡。該技術(shù)體系的關(guān)鍵在于多機(jī)制協(xié)同：熱激促使HSP70分子伴侶包裹病毒粒子，阻斷其復(fù)制酶組裝；水楊酸誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性可清除漏網(wǎng)的病毒RNA；氨基寡糖素則通過激發(fā)茉莉酸信號(hào)通路強(qiáng)化細(xì)胞防御。

2蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)優(yōu)化路徑

蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)應(yīng)用階段，按照上述技術(shù)要點(diǎn)確定培育重點(diǎn)之后，還應(yīng)當(dāng)從整體化培育體系角度進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，使蝴蝶蘭花卉植物在新技術(shù)指導(dǎo)下逐漸發(fā)育成完整植株。

2.1莖尖雙效預(yù)處理技術(shù)體系構(gòu)建

針對(duì)蝴蝶蘭莖尖脫毒的技術(shù)瓶頸，可采用“復(fù)合消毒-低溫鈍化\"雙效預(yù)處理工藝。實(shí)際操作中，選取開花后45d的健康母株，于清晨露水未干時(shí)截取頂端3cm幼嫩莖段。首先進(jìn)行復(fù)合消毒處理：將莖段置于含 0.1% 吐溫-80的超聲波清洗儀 （40kHz） 中震蕩5min，利用空化效應(yīng)剝離表面蠟質(zhì)層；隨后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的 4^°C 消毒液中，該溶液由 2% 次氯酸鈉（含 0.05% Tween-20增強(qiáng)滲透性） .50mg/L 頭孢克肟及 0.1% 氨基寡糖素組成，在磁力攪拌器（300rpm）輔助下處理15min。此階段需嚴(yán)格控制液溫在 （4±0.5）^°C ，低溫環(huán)境既可抑制酚類物質(zhì)氧化，又能增強(qiáng)氨基寡糖素對(duì)病毒外殼蛋白的分解作用。完成化學(xué)消毒后，立即將莖尖轉(zhuǎn)移至無菌操作臺(tái)進(jìn)行顯微解剖。使用體視顯微鏡 （40×） 剝離外層苞片，精確切取 0.3-0.5mm 的頂端分生組織，要求包含1＼～2個(gè)葉原基且維管束原基未分化。將獲取的莖尖外植體置于改良型MS培養(yǎng)基中（附加 0.3mg/L 赤霉素、 1.0mg/L 萘乙酸），于 36^°C 暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期7d的病毒鈍化處理。此階段通過熱激效應(yīng)破壞病毒RNA復(fù)制酶活性，同時(shí)培養(yǎng)基中添加的 2% 二甲亞砜可有效提高細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)抗病毒因子滲透。

雙效預(yù)處理工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如表4所示。復(fù)合消毒階段可清除 85% 以上的表面污染菌，但對(duì)深層次病毒粒子清除率不足 40% ；經(jīng)后續(xù) 36% 熱鈍化處理后，病毒脫除率顯著提升至 90% 以上。電鏡觀察顯示，聯(lián)合處理后的莖尖分生細(xì)胞中線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較單一處理組增加18倍，說明雙效處理在保障細(xì)胞活性的同時(shí)，有效激活了宿主抗病毒機(jī)制。實(shí)際操作中需注意：次氯酸鈉處理超過18min將導(dǎo)致分生細(xì)胞質(zhì)壁分離，而熱鈍化溫度超過 38^°C 會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)不可逆變性，嚴(yán)格的過程監(jiān)控是技術(shù)成功的關(guān)鍵。

2.2調(diào)控組培快繁環(huán)境參數(shù)

該技術(shù)的有效應(yīng)用，還需要通過調(diào)控環(huán)境參數(shù)，達(dá)到預(yù)期培育效果。以水質(zhì)和溫度環(huán)境參數(shù)作為研究重點(diǎn)，觀察不同水質(zhì)（A：可溶性鹽溶度 0.02ms/cm 純凈水；B：0.9ms/cm自來水）及溫度（C：白間 22% 夜間16% ;D：白間 25^°CI 夜間 18^°C） 環(huán)境下，蝴蝶蘭完整植株的長(zhǎng)勢(shì)及最終培育結(jié)果。其中在A水質(zhì)條件下同一批待測(cè)樣本花梗長(zhǎng)度為56cm，花梗伸長(zhǎng)量為 0.95cm/d ；花徑為 9.3cm ；花卉數(shù)量為7.5朵；B條件下分別為 55cm 、0.93cm/d.9cm.7.9 朵；C溫度下開花率為 12% ;D溫度條件下為 49% ；花卉數(shù)量分別為2.2朵、4.6朵；花梗長(zhǎng)度為 10.5cm.18cm ；抽梗率為 45%65% 。經(jīng)對(duì)比確定：若在蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)應(yīng)用過程，水質(zhì)參數(shù)對(duì)培育質(zhì)量的影響較小。若有獲取長(zhǎng)花梗需求，則可以考慮優(yōu)先創(chuàng)造可溶性鹽溶度 0.02ms/cm 純凈水的水質(zhì)條件；溫度調(diào)控部分，則以白間 25% 夜間 18°C 為標(biāo)準(zhǔn)，由此獲得滿意的培育成果。

2.3加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化增殖培養(yǎng)

技術(shù)人員應(yīng)用該技術(shù)培育蝴蝶蘭花卉植物時(shí)，也可采用標(biāo)準(zhǔn)化增殖培養(yǎng)方式，促進(jìn)花梗萌發(fā)。其中在增殖培養(yǎng)前期，需根據(jù)要求，使其在不同階段均能吸收所需營(yíng)養(yǎng)成分。蝴蝶蘭不同生長(zhǎng)階段施肥條件如表5所示。而在蝴蝶蘭進(jìn)入休眠期以后，可通過設(shè)計(jì)增殖培養(yǎng)條件（酸堿度5.5；增殖系數(shù)2.2倍；持續(xù)進(jìn)行12h的1200Lx以上光照培育；溫度 24°C ；培養(yǎng)基為 2% 蔗糖聯(lián)合花寶一號(hào) +2% 蔗糖聯(lián)合 0.1mg/L 植物生長(zhǎng)激素與花寶一號(hào)）激活花梗腋芽活力，并對(duì)恢復(fù)活力的蝴蝶蘭植株進(jìn)行移栽，以實(shí)現(xiàn)健康生長(zhǎng)。

3結(jié)語

蝴蝶蘭花梗腋芽脫毒組培快繁技術(shù)的系統(tǒng)優(yōu)化，標(biāo)志著傳統(tǒng)組培模式向高效、可控方向的轉(zhuǎn)型。通過科學(xué)整合外植體精準(zhǔn)取材、復(fù)合消毒程序及環(huán)境動(dòng)態(tài)調(diào)控，該技術(shù)體系在病毒脫除與植株活性間實(shí)現(xiàn)了協(xié)同提升，為規(guī)模化無毒苗生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。研究揭示的梯度剝離與熱激誘導(dǎo)協(xié)同機(jī)制，不僅深化了對(duì)植物-病毒互作關(guān)系的理解，更為脫毒技術(shù)創(chuàng)新提供了關(guān)鍵理論支撐與實(shí)踐指導(dǎo)。

未來，相關(guān)研究需進(jìn)一步聚焦病毒侵染的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探索植物抗性信號(hào)通路的靶向激活策略，同時(shí)推動(dòng)人工智能技術(shù)在環(huán)境參數(shù)優(yōu)化與生產(chǎn)流程中的應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)與智能裝備技術(shù)的深度融合，蝴蝶蘭脫毒快繁技術(shù)有望邁向精準(zhǔn)化與標(biāo)準(zhǔn)化，為花卉產(chǎn)業(yè)品種升級(jí)與可持續(xù)發(fā)展注入新動(dòng)能。

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作者簡(jiǎn)介：米曉潔（1979一），女，漢族，山東郛城人，碩士研究生，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向?yàn)樘m科植物新品種選育、組織培養(yǎng)技術(shù)和脫毒技術(shù)。