基于TaqMan探針的柑橘黃龍病菌亞洲種實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測方法

關(guān)鍵詞：柑橘黃龍病；柑橘黃龍病菌亞洲種；快速檢測；實(shí)時(shí)熒光PCR中圖分類號(hào)：S436.66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0457（2025）03-0074-05國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2025.03.010

柑橘是世界上第一大類的水果，在世界農(nóng)產(chǎn)品交易中占據(jù)十分重要的位置，全球有近140個(gè)國家和地區(qū)生產(chǎn)柑橘，我國是柑橘的起源中心之一，近年產(chǎn)量位居世界前列。柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是對(duì)柑橘生產(chǎn)危害性最大的一種病害，主要分布在東南亞、非洲、美洲等近50個(gè)國家和地區(qū)，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著巨大的影響[1]。此病原根據(jù)其16SrDNA和 β -操縱子基因的序列特征以及其自身的性質(zhì)可分為3個(gè)種，即亞洲種（CandidatusLiberibacterasiaticus）非洲種（CandidatusLiberibacterafricanus）和美洲種（CandidatusLiberibacter americanus）[1-2]。其中，亞洲種的分布最廣泛，危害最為嚴(yán)重。該病菌可通過媒介昆蟲-柑橘木虱進(jìn)行近距離的傳播，也可以通過帶病的苗木、接穗傳到更遠(yuǎn)的地區(qū)。果樹一旦染病，會(huì)導(dǎo)致樹勢(shì)快速衰退，并伴有黃化葉、畸葉、根系腐爛以及果實(shí)瘦小發(fā)綠等癥狀，若不能提前防治，短短幾年便能導(dǎo)致果園喪失生產(chǎn)價(jià)值，甚至于毀園。HLB能侵染各類的柑橘植物。染病癥狀明顯的主要是甜橙、柑橘和橘柚，在檸檬、葡萄柚、酸橙、金桔和香橡等植株上出現(xiàn)的癥狀稍弱，在青檸和柚子的癥狀更弱[34]。H HLB的出現(xiàn)對(duì)全世界的柑橘生產(chǎn)帶來了巨大的影響。

在我國，柑橘黃龍病主要發(fā)生在南方局部地區(qū)，病原為柑橘黃龍病菌亞洲種（CandidatusLiberibacterasiaticus，CLas），是一種韌皮部桿菌，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌（Bacteria）變形桿菌門（Proteobacteria）變形菌綱（Alphaproteobacteria）根瘤菌目（Rhizobiales）葉桿菌科（Phyllobacteriaceae），該病菌目前無法進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)。

目前，我國農(nóng)業(yè)部門及口岸檢疫部門對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種的檢疫鑒定是按照出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法》（SN/T2071—2008）[5]進(jìn)行，主要是通過對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序后通過BLAST比對(duì)進(jìn)行鑒定[4]該方法耗時(shí)較長，難以實(shí)現(xiàn)口岸快速檢測。國內(nèi)外對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種的檢測技術(shù)也有一些相關(guān)研究。 Li^[6-8] 等根據(jù)16SrDNA、核糖體蛋白基因rpl/rpll、還原酶 β 亞基的nrdb基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)檢測方法，但均主要集中在對(duì)柑橘黃龍病菌或單個(gè)種的檢測，缺少對(duì)柑橘黃龍病菌3個(gè)種之間的區(qū)分；本研究在強(qiáng)化亞洲種鑒別的基礎(chǔ)上，主要針對(duì)亞洲種的檢測，并加入與非洲種和美洲種作為對(duì)照。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在植物病原檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用，相比于普通PCR，它能做到時(shí)間短、靈敏度更高的檢測，是目前常用且可靠的方法[9-10]。為做到柑橘黃龍病菌亞洲種的快速檢測以及相似種的區(qū)分，本研究根據(jù)亞洲種核糖體蛋白基因 rplj/rpll^[11] ，建立了一套實(shí)時(shí)熒光PCR快檢體系，為口岸快檢柑橘黃龍病菌亞洲種提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

供試樣品共27個(gè)（表1），包含19個(gè)柑橘葉片樣品、1個(gè)黃龍病非洲種rp質(zhì)粒、1個(gè)黃龍病美洲種rpj質(zhì)粒以及6個(gè)柑橘上常見且易與柑橘黃龍病癥狀混淆的病害樣品。上述兩個(gè)質(zhì)粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試劑和儀器

磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒購自珠海寶瑞生物公司、Premix Taq^°ledast Version 2.0、Premix ExTaq（ProbeqPCR）購自寶生物（大連）有限公司、球磨儀MM400（德國萊馳）、全自動(dòng)核酸提取儀KingfisherDuoprime（賽默飛世爾）、超微量核酸蛋白檢測儀NanoDropone（賽默飛）、熒光定量PCR儀（A）。引物探針及質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 DNA提取

用 75% 的酒精擦洗樣品表面，清水沖洗后晾干，再用液氮浸泡后研磨成粉。按照磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒的說明書方法對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取，所得DNA通過超微量核酸蛋白檢測儀測定核酸濃度和質(zhì)量，保存于 -20°C 冰箱。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)柑橘黃龍病菌亞洲種及其近似種的rpj基因序列的差異，利用PrimerExpress3.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物lasf（ 5^′ -CCAACGAAAAGATCAGATATTC）、lasr（ 3^′ -AAGGGAATTAGTGTTGCG）和特異性探針laspr（ROX-CACGGATAGCAATCTTGACGAGAC-BHQ2），擴(kuò)增產(chǎn)物大小預(yù)計(jì)為 80bp 。以上引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 特異性試驗(yàn)

以表1中各地采集的樣品DNA為模板，無菌水為空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系 Premix Ex Taq（Probe qPCR） 、0.5μL 引物lasf ∴0.5μL 引物lasr ∴0.5μL 探針 laspr，2μL DNA，其余用無菌水 6.5μL 補(bǔ)至 20μL 。反應(yīng)條件為： 95^°C 預(yù)變性30s;然后以95℃5s， 60°C30s 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在單個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)設(shè)置熒光通道采集熒光信號(hào)。

1. 6 靈敏度試驗(yàn)

為了明確該實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種DNA濃度的檢測限度，以染病樣品HL13為模板，用無菌水按照10倍的濃度梯度進(jìn)行稀釋，共稀釋7個(gè)濃度梯度，并以每個(gè)濃度兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行PCR試驗(yàn)，利用1.5中的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增測試，測定各濃度的靈敏度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

用樣品HL13的DNA為模板進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，以HL13的4個(gè)濃度為參照，重復(fù)3次qPCR，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果的閾值循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold， C_t 值）進(jìn)行分析，并計(jì)算平均 C_t 值、標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard

Deviation， S_p ）和變異系數(shù)（CoefficientofVariation，C_v ），驗(yàn)證此方法的重復(fù)性。

1.8 樣品實(shí)測

以表1中各地收集的有疑似癥狀的柑橘樣品和脫毒材料作為實(shí)測樣品，檢測樣品收集地的柑橘黃龍病發(fā)生情況，并驗(yàn)證該方法的實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性驗(yàn)證

對(duì)表1中兩個(gè)染病樣品（HL04、HL13）、脫毒樣品、美洲種和非洲種對(duì)應(yīng)基因片段的質(zhì)粒以及本實(shí)驗(yàn)室保留的柑橘發(fā)生的其它病害的病原菌，并以無菌水作為空白對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，結(jié)果如圖1所示，兩個(gè)染病樣品有明顯的擴(kuò)增曲線，脫毒樣品、空白對(duì)照、和其它柑橘上常見的病菌均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，在從江縣和榕江縣兩個(gè)不同地理來源的染病樣品均可以檢出；相近種如非洲種、美洲種均無法檢出，體現(xiàn)了該方法對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種的特異性檢測有良好的效果。

2.2 靈敏度測試及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選用特異性擴(kuò)增明顯的染病樣品，經(jīng)DNA含量測定后對(duì)其進(jìn)行10倍的梯度稀釋，共7個(gè)濃度梯度，DNA濃度為 100，10，1，0.1，0.01，0.001 、0.0001ng/μL ，分別設(shè)置2個(gè)重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果具有典型的擴(kuò)增曲線（圖2、圖3），顯示在前5個(gè)

DNA濃度時(shí)的 C_t 值分別為21.07、24.37、28.07、32.84、35.35，在DNA濃度為 0.001ng/μL 及更低濃度時(shí)均無擴(kuò)增曲線，說明本方法對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種的檢測限度在 0.01ng/μL 左右。

通過對(duì)所測定濃度的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測可知，DNA濃度與 C_t 值呈正相關(guān)關(guān)系，DNA濃度與可檢測到的熒光信號(hào)的循環(huán)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)結(jié)果可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 ：y=-3.7x+28（R²=0.9932） 。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

以HL13的DNA的4個(gè)濃度（80、8、0.8、0.08ng/μL ）進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。由表2的結(jié)果可知， C_v 值在 0.12%～0.70% 之間，說明該方法對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.4 實(shí)際樣品檢測

對(duì)表1中由各地果園收集的17個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測。利用本研究所建立的方法，用染病樣品HLO4為陽性對(duì)照，脫毒材料HLN為陰性對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。結(jié)果（圖4）顯示樣品癥狀明顯，均檢出陽性，沒有病變癥狀的樣品也有部分檢出陽性，說明僅通過外表觀察是不準(zhǔn)確的，體現(xiàn)了柑橘黃龍病的潛伏性，也體現(xiàn)了本方法對(duì)柑橘黃龍病檢測的實(shí)用性。

3 討論與結(jié)論

亞洲柑橘黃龍病是國內(nèi)一種重要的檢疫性病害，該病害由一種韌皮部桿菌所引起的，在侵染果樹后，會(huì)導(dǎo)致樹葉變黃，果實(shí)小、畸形且顏色變化不佳，整體植株活力下降，從而導(dǎo)致植株發(fā)育不良，使其產(chǎn)量降低。該病菌具有一定的潛伏期，癥狀表現(xiàn)一般在1＼～3a之間，通常在幼樹中表現(xiàn)得比較快，對(duì)于樹齡長且生長狀態(tài)較好的果樹的潛伏期會(huì)更長[1]。它能侵染大部分的柑橘品種，是我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大阻力。每年都會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，自2012年以來，江西贛州等地黃龍病大面積暴發(fā)，迄今已砍除病樹超過4500萬株，預(yù)估直接經(jīng)濟(jì)損失90 億元以上[12]，廣西由于黃龍病的發(fā)生，損毀柑橘果園累計(jì)超 過4萬 hm² ，造成直接或間接經(jīng)濟(jì)損失超過100 億元[13]。由于該病害的病原菌屬于難純培養(yǎng)的細(xì)菌，癥狀比較復(fù)雜，容易與植株上其他的病害相混淆，且潛伏期較長，在植株染病后不會(huì)過快的表現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)癥狀時(shí)，該植株已經(jīng)到了無法挽救的地步。目前，應(yīng)對(duì)方法主要以培育無病苗木和加強(qiáng)檢疫為主，以防止其傳染與蔓延。因此對(duì)柑橘黃龍病的早期正確診斷對(duì)防治該病具有重要的意義。同時(shí)，建立新型柑橘黃龍病菌亞洲種快檢方法，能更好更快的鑒別該病害并及時(shí)處理，不僅能滿足口岸的相關(guān)鑒定，維護(hù)國內(nèi)外良好的柑橘產(chǎn)品的流通，更對(duì)我國的柑橘產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展有著重要的促進(jìn)作用。

對(duì)于柑橘黃龍病菌亞洲種的相關(guān)研究已經(jīng)持續(xù)了多年，目前已有多種檢測方法，包括常規(guī)PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR 和數(shù)字PCR 等方法[6]上述方法中，以實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR的靈敏度最高，但數(shù)字PCR目前普遍應(yīng)用較為困難，儀器昂貴且操作復(fù)雜[14-15]，對(duì)于大樣本檢測，實(shí)時(shí)熒光PCR具有更好的優(yōu)勢(shì)。

本研究根據(jù)亞洲種核糖體蛋白基因rplj/rpll，在收集近似種的相關(guān)基因序列后，比對(duì)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和一條TaqMan探針，建立了柑橘黃龍病菌亞洲種的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。研究結(jié)果顯示，該方法能有效地?cái)U(kuò)增目的基因片段，特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性均有良好的表現(xiàn)，實(shí)際檢測中也有很好的表現(xiàn)，可用于口岸對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種的初篩與鑒定。

（責(zé)任編輯：嚴(yán)秀芳 于慧梅）

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TaqMan-based Real-time Fluorescence PCR Method for the Rapid Detection of Candidatus Liberibacter Asiaticus

Yang Xiaolong ^1，2 ， Teng Shaona ^1，2 ，He Lin ^1，2 ， Zhou Ling ^1，2 ， Gao Wenna ³ ， Wang Xiqiao ⁴ ， Kong Deying ^1，2 ， Sun Tao ^1，2 * （1.Technology Centerof Chongqing Customs Technology Center， Chongqing 400020，Chongqing，China;2.National KeyLaboratoryof Species Identificationand Quality Safety Testingof Chinese Medicinal Materials，Chongqing 400020， Chongqing， China;3.Science and Technology Research Center of China Customs， Beijing 10026，Beijing，China; 4. Technology Center of Lanzhou Customs District，Lanzhou 73oO3O，Gansu，China）

Abstract：Citrus Huanglongbing isone of themost serious diseases incitrus production inChinaatpresent.In this study，a pair of specific primers and a probe were designed and synthesized acording to the conserved rplj sequence of Candidatus Liberibacter asiaticus. This method can specifically detect the pathogen C .Liberibacter asiaticus.The results of sensitivity test showed that the lowest DNA concentration was 0.01ng/μL in 20μL reaction system. This method can be used for detection and screening of suspected samples infected by C .Liberibacterasiaticus.

KeyWords：Citrus Huanglongbing；Candidatus Liberibacter asiaticus;；rapid detection； real-time fluorescence PCR